張馳，董建國，于林洋，王爽云，范蘭蘭，張樂宜，劉燕玲，王磊，宋長緒*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽 464000)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)可引起任何品種、性別、年齡的豬發(fā)病，其中易感性最高的是母豬和仔豬，且感染后出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀[1]。PRRS是導(dǎo)致母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱仔等繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為主要特征的傳染病[2]。目前豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)分為2個(gè)基因型：基因型1和基因型2，代表性毒株分別為歐洲型Lelystad Virus和美洲型VR-2332[3]。中國內(nèi)陸于1995年首次發(fā)現(xiàn)PRRSV，并在1996年成功分離出第1株P(guān)RRSV毒株CH-1a[4]；2006年，中國南方地區(qū)出現(xiàn)由變異性毒株引起的高發(fā)病率和高死亡率的疫情[5-6]，隨后蔓延至全國大部分地區(qū)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

PRRSV為單股正鏈RNA有囊膜病毒，基因全長約為15～15.5 kb[7]，至少含有10個(gè)開放閱讀框(ORF)，包括ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7[8]。在ORF1a中的NSP2基因最容易變異，主要含3個(gè)區(qū)域：N末端的半胱氨酸酶區(qū)、中部的高變區(qū)和C末端疏水的轉(zhuǎn)膜區(qū)，NSP2發(fā)生的變異主要位于中部的高變區(qū)[9]。NSP2區(qū)域在許多PRRSV分離毒株中存在氨基酸缺失，這是PRRSV基因組長度差異的一個(gè)主要原因。ORF5編碼的糖基化囊膜蛋白GP5有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，常被作為構(gòu)建PRRSV診斷的重要靶標(biāo)[10]。GDZS2016為近年來廣東地區(qū)流行毒株，與JXA1毒株在同一分支，相關(guān)文章報(bào)道其能造成臨床發(fā)病率為90%，死亡率為10%，不具有感染Marc-145細(xì)胞的能力，但可感染PAM細(xì)胞[11]。PRRSV發(fā)生基因重組的頻率很高，可能導(dǎo)致新型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)的出現(xiàn)[12-13]。

2018年7月，本實(shí)驗(yàn)室從廣東省江門市某PRRS發(fā)病豬場采集肺臟組織樣本，PCR檢測(cè)結(jié)果為PRRSV陽性，在Marc-145細(xì)胞上無法分離純化，最終在原代豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages,PAM)上成功分離，將其命名為GDjm株。對(duì)全基因組進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與其他代表PRRSV毒株進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析，進(jìn)而分析GDjm毒株與國內(nèi)流行的PRRSV毒株的相似性和重組情況，為深入研究該病毒株的遺傳與變異奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

肺臟病變組織來源于廣東省江門市疑似發(fā)生PRRS某養(yǎng)殖場，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞、菌體

Marc-145細(xì)胞、PAM細(xì)胞、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心種豬疾病防控實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及膠回收試劑盒盒購自Promega公司；RT-PCR相關(guān)試劑盒購自Vazyme公司；DNA Marker DL2000等購自廣州東盛生物科技有限公司；EB替代染料(GoldviewⅠ)購自廣州華奇盛生物科技有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自天根生物科技(北京)有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的PRRSV毒株全基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選取保守區(qū)域設(shè)計(jì)14對(duì)特異性引物(表1)用于擴(kuò)增序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 病料處理

取1 g肺臟組織剪碎，加入1 mL PBS在冰上充分研磨。將研磨液倒入潔凈的1.5 mL 離心管中，12 000 r/min離心3 min，收集上清后在超凈工作臺(tái)中用0.22 μm微孔過濾器過濾，取200 μL 濾液用于病毒核酸提取，并通過PCR進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬細(xì)小病毒(PPV)檢測(cè)，其余濾液置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 病毒分離

采用PAM細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞從樣品中分離PRRSV。將處理好的臨床樣品感染PAM和Marc-145細(xì)胞，盲傳3代，并觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。收毒后反復(fù)凍融3次，每代取200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液于無RNA酶的離心管中，用于提取核酸和PCR檢測(cè)。

表1 擴(kuò)增全基因序列引物

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)

將PAM細(xì)胞和Marc-145接至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次。每孔接種10 μL上述濾過液，設(shè)立空白對(duì)照，放在于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄掉液體，PBS輕輕沖洗3次，各孔加入500 μL含有2% FBS的細(xì)胞維持液，觀察培養(yǎng)25 d后棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，各孔加進(jìn)200 μL固定液于-20 ℃固定20 min，棄掉液體，PBS洗滌3次；然后各孔加入200 μL 0.5% Triton X-100室溫穿膜10 min，棄掉液體后PBS洗滌3次；加入200 μL的1∶400倍稀釋的一抗(鼠源抗N蛋白單抗)，置于37 ℃孵育1 h，期間每20 min輕輕搖晃1次，確保充分吸附，棄去液體后PBS洗滌5次；避光加入200 μL稀釋后的熒光二抗(FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG)，37 ℃條件下避光作用1 h，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.8 提取核酸及反轉(zhuǎn)錄

將收集的上清液取200 μL，采用Promega公司提供的試劑盒進(jìn)行病毒核酸提取和反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存。

1.9 目的基因分段擴(kuò)增

采用TAKARA公司提供的高保真酶對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為50 μL，PrimeSTAR Max Premix (2×) 0.5 μL、5× PrimeSTAR Buffer 10 μL、dNTP Mixture 4 μL、RNase-free H2O 27.5 μL、cDNA模版4 μL，上下游引物各2 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性1min；98 ℃變性10s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.10 基因克隆、測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳鑒定后，使用Promega公司提供的膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。取4 μL膠回收產(chǎn)物1 μL pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 25 ℃連接25 min，轉(zhuǎn)化后挑菌鑒定，將陽性菌液送往生物公司測(cè)序。

1.11 序列分析

表2所示PRRSV代表毒株基因序列均來自GenBank。運(yùn)用Lasergene與Mega 5.0軟件將測(cè)序毒株與國內(nèi)外代表毒株進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建，并將GDjm毒株NSP2與GP5基因氨基酸序列與國內(nèi)外代表毒株進(jìn)行比對(duì)分析。通過SimPlot軟件對(duì)GDjm株進(jìn)行全基因重組分析。

表2 PRRSV參考毒株信息

毒株名稱登錄號(hào) 來源年份CH-1aAY032626中國2000CH-1REU807840.1中國2008CHsx1401KP861625.1中國2015CWZ-1-F3FJ889130.1中國2009GDEU825724.1中國2008GDZS2016MH046843.1中國2016GM2JN662424.1中國2011HB-1(sh)AY150312中國2002HUN4EF635006.1中國2007HENXX-1KU950372.1中國2014Lelystad virusNC_043487.1歐洲1993NVDC-CQ4-2012KP771777.1中國2015NADC30MH500776.1中國2018JXA1EF112445.1中國2006JXA1 P80FJ548853.1中國2009JXA1 P160KC422731.1中國2013JXwn06EF641008.1中國2007JSWAKY373214.1中國2016QY2010JQ743666.1中國2012QYYZJQ308798.1中國2011RespPRRS-MLVAF066183美國2005SCN17MH078490.1中國2017VR-2332AY150564.1丹麥2002WUH4EU187484.1中國2007

2 結(jié)果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測(cè)

使用ORF5基因檢測(cè)引物對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明(圖 1)，檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果(864 bp)相符。

M. DNA Marker DL2000；1. 樣品；2. 陽性對(duì)照；3. 陰性對(duì)照

圖1 PRRSV ORF5基因片段擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 病毒分離與IFA

在Marc-145細(xì)胞多次接毒后未出現(xiàn)CPE，隨后將處理后的病料分別接種于Marc-145細(xì)胞與PAM細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)N蛋白。如圖2所示，Marc-145細(xì)胞無熒光，PAM細(xì)胞上有明顯的熒光信號(hào)，證明分離毒可感染PAM細(xì)胞但不感染Marc-145細(xì)胞。

A. 未接毒Marc-145細(xì)胞；B. 接毒Marc-145細(xì)胞;C. 未接毒PAM細(xì)胞；D. 接毒PAM細(xì)胞

圖2 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

2.3 PRRSV GDjm全基因組測(cè)定

使用14對(duì)相互重疊的特異性引物擴(kuò)增全基因。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，擴(kuò)增的14個(gè)產(chǎn)物大小與預(yù)期一致(圖 3)。將擴(kuò)增片段膠回收連接載體后測(cè)序，使用SeqMan軟件拼接序列，獲得全基因序列全長為15 249 bp，命名為GDjm株。

M.DNA Marker DL2000；1～14. PCR擴(kuò)增的14個(gè)片段

圖3 PRRSV GDjm全基因RT-PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳

2.4 PRRSV GDjm基因進(jìn)化樹構(gòu)建與同源性分析

應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)GDjm毒株與國內(nèi)外代表性毒株進(jìn)行全基因組進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果如圖4所示。遺傳進(jìn)化樹分為歐洲型代表毒株Lelystad virus和美洲型代表毒株VR-2332兩大分支，以VR-2332為代表的美洲型又可進(jìn)一步分為以JXA1、JXwn06為代表的高致病毒株分支，以我國CH-1a與VR-2332為代表的低致病性毒株分支，以及美國NADC30為代表的分支和近年來出現(xiàn)的QYYZ為代表的分支。如圖所示，GDjm株與華南地區(qū)近年新出現(xiàn)的重組毒GDZS2016同源性最高，并位于JXA1、JXwn06等為代表的高致病性毒株和以CH-1a為代表的經(jīng)典毒株中間。故判定GDjm株可能為重組毒株。

利用DNAStar軟件對(duì)PRRSV全基因核苷酸序列分析，結(jié)果如圖5所示，GDjm與GDZS2016、HUN4、NVDC-CQ4-2012、WUH4、JXA1的同源性分別為96.2%、96.0%、95.7%，95.5%、95.4%，與NADC30同源性為82%，與美洲型代表毒株VR2332同源性為87.4%，與歐洲型代表株Lelystad virus同源性僅為57.9%。

●標(biāo)注毒株為所測(cè)毒株

圖4 PRRSV全基因組的進(jìn)化樹分析

圖5 PRRSV-GDjm全基因序列比對(duì)結(jié)果

2.5 GDjm NSP2與GP5氨基酸序列比對(duì)及核苷酸同源性分析

運(yùn)用DANStar對(duì)GDjm和國內(nèi)代表典毒株進(jìn)行NSP2氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果如圖6所示，GDjm毒株在511、534～562位存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸的缺失，此外在531位存在T531I突變。

運(yùn)用DNAStar軟件對(duì)GDjm和國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行GP5氨基酸序列比對(duì)(圖7)。GDjm在29位有A29V變異；在185位有V185A突變；在189位有I189L突變；在39位有1個(gè)L39I突變。此外GDjm還存在多個(gè)突變位點(diǎn)，在34位存在D34G突變，58位有N58E突變，107位有V107A突變，196位有Q196R突變。

方框中為核苷酸變異位點(diǎn)，下同

圖6 PRRSV-GDjm NSP2氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖7 PRRSV GDjm GP5氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.6 PRRSV全基因重組部位特征分析

運(yùn)用SimPlot軟件將GDjm株與高致病性毒株HUN4和近年來華南地區(qū)毒株GDZS2016進(jìn)行全基因組重組分析。經(jīng)分析得出(圖8)：GDjm株為高致病毒株HUN4與GDZS2016進(jìn)行重組的重組毒株。重組區(qū)域分別為6 723～9 521 bp、11 998～15 019 bp。

坐標(biāo)尺：200 bp；區(qū)分度：20 bp

圖8 PRRSV GDjm毒株重組分析

3 討論

PRRS是全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。我國分離得到的毒株以北美型PRRSV為主。防控PRRS的疫苗主要有經(jīng)典毒株和高致病性毒株減毒活疫苗以及滅活疫苗[14]。我國PRRSV流行的種類眾多，研發(fā)和生產(chǎn)疫苗的廠家眾多，毒株的選用以及生產(chǎn)方式皆有不同，導(dǎo)致使用混亂。養(yǎng)殖場也可能在免疫流程中使用不同型號(hào)的疫苗，使毒株間發(fā)生遺傳重組的可能性增加，加上RNA病毒復(fù)制酶低保真性和自身免疫系統(tǒng)的影響[15]，進(jìn)而加速PRRSV變異。

本試驗(yàn)對(duì)廣東省江門市疑似發(fā)生PRRS的豬場采集病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果呈陽性；通過對(duì)GDjm毒株全基因組測(cè)序，并對(duì)其與其他PRRSV毒株同源性進(jìn)行比較和構(gòu)建進(jìn)化樹分析。全基因組分析中GDjm與GDZS2016同源性最高，為96.2%。NSP2是PRRSV最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，容易發(fā)生缺失和突變，基因長度約為2.9 kb。 GDjm毒株NSP2氨基酸序列比對(duì)結(jié)果與高致病性毒株HUN4、JXA1、JXwn06和高致病疫苗株JXA1-P80相似，在511、534～562位存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸的缺失，符合高致病性毒株特點(diǎn)。美洲型毒株GP5蛋白的表位有3個(gè)，aa27～aa30和aa180～aa197為非中和表位，aa37～aa45為中和表位[16]。與美洲型代表毒株VR-2332相比，GDjm在非中和表位中有1個(gè)A29V的變異；在185位有V185A突變，該突變與高致病性毒株及其疫苗株相同；在189位有I189L突變，該突變與經(jīng)典毒株和高致病性毒株及其疫苗株相同。中和表位中，在39位有1個(gè)L39I突變，該突變與高致病性毒株及其疫苗株相同。

GDZS2016株是華南地區(qū)2016年出現(xiàn)的重組毒株，相關(guān)文章報(bào)道其能造成臨床發(fā)病率為90%，死亡率為10%，現(xiàn)研究表明該毒株只能感染PAM細(xì)胞，對(duì)Marc-145不具有感染性[17]。HUN4毒株是高致病毒株，臨床試驗(yàn)表明其能造成發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%，均能使Mare-145和PAM感染[18]。全基因重組部位特征分析表明HUN4與GDZS2016重組，重組區(qū)域8 558～9 462 bp、11 995～12 982 bp。這2個(gè)片段編碼病毒RNA復(fù)制酶、聚合酶GP2、GP3、GP4、GP5[19]，它們的重組可能與GDjm毒株不能感染Marc-145細(xì)胞相關(guān)。綜上所述，GDjm毒株為HUN4與GDZS2016的重組毒株，具有致病性增強(qiáng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，加大了廣東地區(qū)PRRSV防控的難度，因此有必要開發(fā)新型疫苗預(yù)防疾病的發(fā)生，并早日解決PRRSV感染與流行的問題。