李 麗，袁建琴，王文斌

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西晉中 030801）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）是薔薇科山楂屬果實(shí)，又名山里果、山里紅，是中國(guó)特有食藥兩用的樹(shù)種[1]。其藥用歷史已有兩千多年，可以抗氧化、降低血脂血糖[2-4]，也是健脾開(kāi)胃、消食化滯的良藥，對(duì)胸膈脾滿、疝氣等也有好的療效[5-8]。

多酚是在植物性食物中發(fā)現(xiàn)的，別稱為植物單寧，它的抗氧化功能可以對(duì)慢性病起到預(yù)防效果。一般存在于一些常見(jiàn)的植物性食物中，如可可豆、茶、蔬菜和水果，在山楂中也能提取到[9-10]。李啟彭等[11]在用超聲波法提取的山楂果肉中多酚含量為19.741 mg/g，果皮中多酚含量為67.148 5 mg/g，試驗(yàn)結(jié)果表明，在12種水果中，山楂的多酚含量最多，且果皮的多酚含量高于果肉。柳偉等[12]在用超聲波法測(cè)定12種種皮多酚的研究中得出山楂皮中的多酚含量最多，為44.83mg/g。閃式提取根據(jù)組織破碎提取原理，其一次提取常在數(shù)秒至幾分鐘即可完成，適用于酶、多酚類(lèi)等穩(wěn)定性差的成分。王明華等[13]認(rèn)為閃式提取法可將細(xì)胞完全打破，更有利于提取。

該試驗(yàn)旨在利用閃式提取法快的特點(diǎn)來(lái)提取測(cè)定山楂果肉中的多酚的含量，探討提取時(shí)間、料液比、電壓這些條件對(duì)提取率的影響，依據(jù)其性質(zhì)，在單因素提取條件基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)考察幾個(gè)關(guān)鍵因素在閃式提取中對(duì)多酚得率的影響，篩選出山楂多酚的最佳提取條件，為今后對(duì)山楂活性成分的提取及功能的深入研究奠定基礎(chǔ)，對(duì)于提高山楂的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、拉長(zhǎng)山楂產(chǎn)業(yè)鏈有重要的意義[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：市售。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、福林酚、無(wú)水乙醇（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-50T中草藥閃式提取器：河南智晶生物科技股份有限公司；SBZ-019中草藥粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；GZX-9023MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；7200-型分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有限公司；ZF-20L抽濾真空泵：鄭州市亞榮儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

將山楂洗凈，然后人工去核，將去過(guò)核的山楂果肉置于60 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品母液0、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL于6個(gè)10 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容，得到質(zhì)量濃度分別為0、0.024 mg/mL、0.048 mg/mL、0.072 mg/mL、0.096 mg/mL、0.120 mg/mL的沒(méi)食子酸待測(cè)液，用移液槍吸取6個(gè)容量瓶中的待測(cè)液0.2 mL于6個(gè)試管中，再分別加入1 mL 10%福林酚顯色劑，5 min后加入3 mL飽和Na2CO3溶液，振蕩搖勻，使其在室溫條件下黑暗反應(yīng)1 h，于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度值。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=4.113 1X+0.026 4（R2=0.991 4），線性關(guān)系良好。

1.3.3 多酚閃式提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

料液比的確定：稱取1 g山楂粉于5個(gè)試劑瓶中，按料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液于試劑瓶中，搖勻，室溫（25 ℃）條件下用閃式提取器在提取電壓100 V條件下提取60 s，5 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液于10 mL容量瓶中，體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容。分別從容量瓶中吸取0.2 mL溶液，后續(xù)步驟同1.3.2，以體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作為空白對(duì)照[16]。同理，依次考察提取時(shí)間（60 s、70 s、80 s、90 s、100 s）、提取電壓（100 V、110 V、120 V、130 V、140 V）對(duì)多酚得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken原理，選取料液比（A）、提取時(shí)間（B）和提取電壓（C）3個(gè)因素，以多酚得率（E）為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以獲得最佳的提取條件[18]。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 山楂果肉中多酚閃式提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for flash extraction process optimization of polyphenols from hawthorn pulp

1.3.5 多酚得率的測(cè)定方法[19]

吸取0.2 mL已制備好的多酚提取液，采用和標(biāo)曲制作相同的方法測(cè)定樣品吸光度值A(chǔ)；求山楂粉末中多酚的質(zhì)量濃度C；山楂多酚得率計(jì)算公式如下：

式中；E為山楂多酚得率，mg/g；C為多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣液體積，mL；M為山楂粉末質(zhì)量，g。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用DesignExpert8.0軟件處理與分析響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚閃式提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)山楂果肉中多酚得率的影響

圖1 料液比對(duì)山楂果肉中多酚得率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on polyphenols yield from hawthorn pulp

由圖1可知，隨著料液比的不斷增加，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，料液比為1∶40（g∶mL）時(shí)，多酚得率最高為36.33 mg/g。其原因可能是提取時(shí)的液體較多，濃度相對(duì)減小，導(dǎo)致刀片與山楂的剪切率下降，使山楂中多酚的有效成分提取不完全，也可能是其他物質(zhì)的溶出而抑制了多酚的提取。由此確定，1∶40（g∶mL）是提取多酚的最佳料液比。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)山楂果肉中多酚得率的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)山楂果肉中多酚得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polyphenols yield from hawthorn pulp

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，提取時(shí)間為80 s山楂樣品溶液的多酚得率達(dá)到最大，為35.27 mg/g，繼續(xù)增加提取時(shí)間后多酚得率逐漸下降，分析原因可能在提取的過(guò)程中刀頭不斷剪切，產(chǎn)生較多熱量，繼而隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液溫度升高很快，不穩(wěn)定的化學(xué)成分易發(fā)生變化[10]，由此確定80 s為最佳提取時(shí)間。

2.1.3 提取電壓對(duì)山楂果肉中多酚得率的影響

圖3 提取電壓對(duì)山楂果肉中多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction voltage on polyphenols yield from hawthorn pulp

由圖3可知，隨著提取電壓的不斷升高，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)閃式提取電壓達(dá)到110 V時(shí)，多酚得率最大，為34.92 mg/g，這可能是由于在高速電機(jī)的帶動(dòng)下，內(nèi)外刀在高速旋轉(zhuǎn)的過(guò)程中影響了某一部分多酚的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率減少。因此，山楂在該條件下最佳提取電壓為110 V。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果[20-22]

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 山楂果肉中多酚閃式提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for flash extraction process optimization of polyphenols from hawthorn pulp

續(xù)表

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面模型為：E=42.72+0.76A-0.91B+1.39C-2.38AB-1.89AC+0.037BC-4.11A2-6.14B2-3.43C2?；貧w分析與方差分析結(jié)果及交互作用的響應(yīng)面分析結(jié)果分別見(jiàn)表3和圖5。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型的F值為107.76（P＜0.000 1），說(shuō)明整體模型差異極顯著。一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)山楂樣液的多酚得率影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AC對(duì)山楂樣液的多酚得率影響顯著（P＜0.05），BC對(duì)其影響不顯著（P＞0.05）?；貧w模型的決定系數(shù)R2=0.996 3，說(shuō)明該模型可信度高，失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著。這說(shuō)明該模型與數(shù)據(jù)擬合程度較高，試驗(yàn)誤差小，可用該模型分析和預(yù)測(cè)山楂多酚閃式提取的結(jié)果。

圖5 料液比、提取時(shí)間、提取電壓交互作用對(duì)山楂果肉多酚得率的影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between material to liquid ratio,extraction time and voltage on polyphenols yield from hawthorn pulp

由圖5可知，料液比對(duì)多酚得率的影響較提取時(shí)間大。在一定范圍內(nèi)，料液比的提高有利于多酚向溶液中轉(zhuǎn)移；料液比-提取電壓交互作用的傾斜率較小，曲線較緩，兩者的交互作用可以看出料液比比提取電壓對(duì)多酚得率的影響更為顯著；提取電壓與提取時(shí)間的交互作用對(duì)多酚提取率的影響，可以看出提取電壓比提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響更為顯著。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照選定的條件，結(jié)合數(shù)學(xué)模型得到閃式提取的最佳條件為料液比1∶41（g∶mL）、提取電壓112 V、提取時(shí)間79 s，模型預(yù)測(cè)多酚得率是42.91 mg/g。為驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性，在該條件下進(jìn)行山楂多酚提取，重復(fù)試驗(yàn)3次，得到多酚得率均值為42.98 mg/g，此值接近于模型預(yù)測(cè)值，說(shuō)明優(yōu)化的提取工藝是合理的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以山楂果肉為原料，利用閃式提取法和響應(yīng)面分析法對(duì)多酚提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最優(yōu)閃式提取工藝為料液比1∶41（g∶mL）、提取時(shí)間79 s、提取電壓112 V，在此條件下，山楂果肉的多酚得率為42.98 mg/g。