趙 航，陳 沙，張 璇，陳桂光，梁智群，龍曉鵬

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530004）

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種以β-葡聚糖鏈通過氫鍵作用形成的多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物[1]。細(xì)菌纖維素作為一種由微生物合成的天然高分子聚合物，具有優(yōu)良的生物兼容性[2]、生物降解性、生物適應(yīng)性、納米材料特性[3]以及獨(dú)特的理化性質(zhì)和機(jī)械性能（如高純度[4]、高結(jié)晶度、高抗張力[5]、高持水性[6]、高通透性等[7-8]）。目前細(xì)菌纖維素已被報(bào)道在食品、醫(yī)療、化妝品、紡織、導(dǎo)電材料及組織工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9-10]。

目前已報(bào)道多種細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株，但是能夠大量合成細(xì)菌纖維素且能明顯成膜的菌株主要來自醋桿菌屬（Acetobacter）[7]。盡管目前已有大量關(guān)于優(yōu)良菌株選育[11-13]、發(fā)酵工藝優(yōu)化[14]、生物合成及調(diào)控機(jī)制[15]、細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)表征的相關(guān)研究[16]，但是細(xì)菌纖維素產(chǎn)量仍較低，難以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。其中，圍繞培養(yǎng)基組分及濃度、發(fā)酵條件及發(fā)酵方式的發(fā)酵工藝優(yōu)化是提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的有效途徑。薛璐等[17]研究發(fā)現(xiàn)，醋酸桿菌C2利用果糖、蔗糖和甘露醇作為碳源可以獲得較高的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，其中以甘露醇為碳源時(shí)的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到4.2 g/L。SON H J等[18]對(duì)多種氮源進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)添加酵母膏為0.5%時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高達(dá)到2.87 g/L。馬霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加適量乙酸和乳酸可提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。此外，細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為4.0～6.0，發(fā)酵溫度為28～30 ℃[15]。上述發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化大多是通過動(dòng)態(tài)發(fā)酵方式實(shí)現(xiàn)。盡管動(dòng)態(tài)方法方式具有更高的溶氧水平和底物利用效率，但是由于機(jī)械攪拌或氣流運(yùn)動(dòng)造成的發(fā)酵過程中細(xì)菌纖維素成膜困難和性能不穩(wěn)定，使得細(xì)菌纖維素產(chǎn)量較難提高。相對(duì)于動(dòng)態(tài)發(fā)酵，靜態(tài)發(fā)酵具有工藝簡單、設(shè)備要求低、產(chǎn)物性能穩(wěn)定以及細(xì)菌纖維素產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[20]，是細(xì)菌纖維素生產(chǎn)的一種較為理想的發(fā)酵方式。

本研究以實(shí)驗(yàn)室自主選育獲得的一株細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter）J2-1為試驗(yàn)菌株，采用靜態(tài)發(fā)酵方式，利用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，以期提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，為后續(xù)中試研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter）J2-1：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、甘油、檸檬酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、乙醇、Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O（均為分析純）：上海泰坦科技股份有限公司；蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米漿干粉：山東聚慈玉米生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏2.5 g/L，檸檬酸2 g/L，Na2HPO4·12H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L；初始pH 5.0，115 ℃滅菌30 min后加入無水乙醇2%（V/V）。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，檸檬酸2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L；初始pH 5.8，115 ℃滅菌30 min后加入無水乙醇2%（V/V）。

1.2 儀器與設(shè)備

PL303精密電子天平：德國METTLERTOLEDO公司；HVE-50高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SKY-211B搖床培養(yǎng)箱：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

從斜面上挑取一環(huán)菌苔，接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，制成種子液。將種子液以2%（V/V）的接種量接種于裝有50 mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

1.3.2 靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)培養(yǎng)基碳源種類（葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇和甘油）及碳源添加量（20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L和100 g/L）、氮源種類（蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母粉和玉米漿干粉）及氮源添加量（6 g/L、10 g/L、14 g/L、18 g/L和22 g/L）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（0、1%、2%、3%、4%和5%）、Na2HPO4·12H2O添加量（0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L）、有機(jī)酸種類（檸檬酸、乙酸、乳酸和蘋果酸）及最佳有機(jī)酸添加量（1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L）、MgSO4·7H2O添加量（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L和0.5 g/L）進(jìn)行單因素優(yōu)化。培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)中，所試驗(yàn)因素的濃度與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度一致；其他因素的濃度，若已優(yōu)化則與優(yōu)化后的濃度一致，若未優(yōu)化則與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度一致。

1.3.3 靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖添加量（A）、MgSO4·7H2O添加量（B）和酵母粉添加量（C）進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，正交優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium composition optimization

1.3.4 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，細(xì)菌纖維素經(jīng)去離子水漂洗干凈后，置于0.5 mol/L NaOH溶液中沸水浴0.5 h，然后置于去離子水中反復(fù)浸泡至乳白凝膠狀，90 ℃烘干至恒質(zhì)量。細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（g/L）計(jì)算：細(xì)菌纖維素干質(zhì)量與發(fā)酵培養(yǎng)基體積的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源種類及最佳碳源添加量

圖1 不同碳源種類（A）和葡萄糖添加量（B）對(duì)菌株J2-1細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources (A) and glucose addition (B)on bacterial cellulose production by strain J2-1

在細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，碳源既是菌體生長的能量來源又是細(xì)菌纖維素合成的底物。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[17]，選取葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇和甘油進(jìn)行碳源種類及最佳碳源添加量優(yōu)化，結(jié)果見圖1。由圖1A可知，葡萄糖、果糖、甘露醇和甘油均有利于細(xì)菌纖維素產(chǎn)生，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d產(chǎn)量均在5 g/L左右；而蔗糖作為碳源時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量較低，僅為（2.34±0.12）g/L。綜合考慮細(xì)菌纖維素產(chǎn)量及原料成本等因素，選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。

設(shè)置葡萄糖添加量分別為20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L和100 g/L，考察葡萄糖添加量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響。由圖1B可知，當(dāng)葡萄糖添加量為20～80 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量也隨葡萄糖添加量增加而增大；當(dāng)葡萄糖添加量為80 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到（5.27±0.05）g/L；當(dāng)葡萄糖添加量＞80 g/L之后，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量反而降低。因此，選擇葡萄糖最佳添加量為80 g/L。

2.1.2 氮源種類及最佳氮源添加量

圖2 不同氮源種類（A）和酵母粉添加量（B）對(duì)菌株J2-1細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources (A) and yeast extract powder addition (B) on bacterial cellulose production by strain J2-1

在細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，一般使用有機(jī)氮源，其一方面能夠?yàn)榫w生長提供氮素，另一方面有機(jī)氮源中豐富的維生素和微量元素能夠作為細(xì)菌纖維素合成相關(guān)酶的輔助因子。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及前期試驗(yàn)結(jié)果[18]，選取蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母粉和玉米漿干粉進(jìn)行氮源種類及最佳氮源添加量優(yōu)化，結(jié)果見圖2。由圖2A可知，酵母膏和酵母粉更有利于細(xì)菌纖維素生產(chǎn)，其中以酵母粉為氮源時(shí)，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到最大，為（5.68±0.06）g/L，因此，選擇酵母粉作為最優(yōu)氮源。

設(shè)置酵母粉添加量分別為6 g/L、10 g/L、14 g/L、18 g/L和22 g/L，考察酵母粉添加量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響。由圖2B可知，隨著酵母粉添加量在6～18 g/L范圍內(nèi)的增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)酵母粉添加量為18 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到（7.43±0.07）g/L；當(dāng)酵母粉添加量＞18 g/L之后，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量下降。因此，選擇酵母粉最佳添加量為18 g/L。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

在細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，乙醇作為輔助碳源對(duì)葡糖酸醋桿菌的生長和細(xì)菌纖維素合成具有促進(jìn)作用。按體積百分比設(shè)置乙醇添加量，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加乙醇時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為（6.19±0.19）g/L；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)在1%～2%范圍內(nèi)增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到（7.39±0.12）g/L，提高了19.4%，促進(jìn)效果較為明顯；但是，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞2%之后，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量明顯降低，甚至低于不添加乙醇時(shí)的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，這可能是由于過量的乙醇抑制菌體生長的結(jié)果。因此，選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株J2-1細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on the bacterial cellulose production by strain J2-1

2.1.4 Na2HPO4·12H2O及MgSO4·7H2O添加量

在細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，Na2HPO4·12H2O能夠?yàn)榫w生長提供磷源，同時(shí)對(duì)發(fā)酵液pH具有緩沖作用。Mg2+作為細(xì)菌纖維素合成酶的激活劑，對(duì)細(xì)菌纖維素合成具有促進(jìn)作用。設(shè)置Na2HPO4·12H2O添加量0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L，MgSO4·7H2O添加量0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L和0.5 g/L，考察Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O添加量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4A可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加Na2HPO4·12H2O時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為（6.06±0.15）g/L；當(dāng)Na2HPO4·12H2O添加量為1～3 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)Na2HPO4·12H2O添加量為3 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到（7.49±0.10）g/L，提高了23.6%；當(dāng)Na2HPO4·12H2O添加量＞3 g/L之后，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量不再升高。因此，選擇最佳Na2HPO4·12H2O添加量為3 g/L。

由圖4B可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加MgSO4·7H2O時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為（8.06±0.13）g/L；當(dāng)MgSO4·7H2O添加量在0.1～0.4 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0.4g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到（9.34±0.20）g/L，提高了15.9%；當(dāng)MgSO4·7H2O添加量＞0.4 g/L之后，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量有所下降。因此，選擇最佳MgSO4·7H2O添加量為0.4 g/L。

2.1.5 有機(jī)酸種類及濃度

在細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，有機(jī)酸不僅作為輔助碳源對(duì)菌體生長和細(xì)菌纖維素合成具有促進(jìn)作用，而且可以與Na2HPO4·12H2O一起對(duì)發(fā)酵液pH具有緩沖作用。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及前期試驗(yàn)結(jié)果[19]，以不加有機(jī)酸為對(duì)照，選取檸檬酸、乙酸、乳酸和蘋果酸4種有機(jī)酸，考察有機(jī)酸種類及最佳有機(jī)酸添加量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。由圖5A可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加任何有機(jī)酸時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為（6.43±0.17）g/L；當(dāng)培養(yǎng)基中添加檸檬酸、乙酸、乳酸和蘋果酸任意一種有機(jī)酸時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量都有所提高，特別是培養(yǎng)基中添加乳酸時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高達(dá)到（8.35±0.24）g/L，提高了28.8%。因此，選擇乳酸作為最優(yōu)有機(jī)酸。設(shè)置乳酸添加量為1g/L、2g/L、3g/L、4g/L和5g/L，考察乳酸濃度對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響。由圖5B可知，當(dāng)乳酸添加量為1～2 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)添加2 g/L乳酸時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，為（8.28±0.30）g/L；當(dāng)乳酸添加量＞2 g/L之后，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量有所降低，這可能是由于高濃度乳酸對(duì)菌體生長有所抑制的結(jié)果。因此，選擇最佳乳酸添加量為2 g/L。

圖5 不同有機(jī)酸（A）和乳酸添加量（B）對(duì)菌株J2-1 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different organic acids (A) and lactic acid addition (B)on the bacterial cellulose production by strain J2-1

2.2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)

單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于乙醇、Na2HPO4·12H2O和乳酸，葡萄糖、MgSO4·7H2O和酵母粉在最優(yōu)濃度條件下對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的提高更為顯著。因此，以細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取葡萄糖（A）、MgSO4·7H2O（B）和酵母粉（C）添加量進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，葡萄糖、MgSO4·7H2O和酵母粉對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響程度為：葡萄糖＞MgSO4·7H2O＞酵母粉。根據(jù)正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果，葡萄糖、MgSO4·7H2O和酵母粉的最佳組合為A2B2C2，即葡萄糖添加量80 g/L、酵母粉添加量18 g/L，MgSO4·7H2O 添加量0.4 g/L。在此最佳培養(yǎng)基組分條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量平均值為9.34 g/L。由表3可知，葡萄糖對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05），而MgSO4·7H2O和酵母粉對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05）。

表2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium composition optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

3 結(jié)論

利用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)葡糖醋桿菌J2-1靜態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定培養(yǎng)基最優(yōu)組分：葡萄糖80 g/L、酵母粉18 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)2%（V/V）、Na2HPO4·12H2O 3 g/L、乳酸2 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到9.34 g/L，是優(yōu)化前細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的1.89倍。下一步將在培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)針對(duì)其中試放大開展研究，以期為細(xì)菌纖維素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。