朱 丹 ，朱立斌，苗欣月，顏飛翔，牛廣財(cái)*，魏文毅，賈 建

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）

毛酸漿（Physalis pubescensL.）別名洋菇娘、黃菇娘等，茄科酸漿屬的一年或多年生草本植物。毛酸漿為藥食兩用植物，具有清熱解毒、利咽化痰等功效[1-2]。其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，顏色橙黃，酸甜可口，深受大眾的喜愛(ài)，是一種寶貴的植物資源，具有重大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[3]。目前，以毛酸漿為主要原料開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的產(chǎn)品逐漸增多，主要有果汁、罐頭、果酒、果醋、果凍、果醬和果脯等[4-8]。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者的營(yíng)養(yǎng)與保健意識(shí)逐漸增強(qiáng)，對(duì)毛酸漿新產(chǎn)品的需求與日俱增，開(kāi)發(fā)具有獨(dú)特風(fēng)味的乳酸發(fā)酵型果蔬飲品具有廣闊的發(fā)展前景。

乳酸菌是一類發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌總稱，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物具有抗衰老、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤、改善胃腸菌群等保健功效[9-11]。利用乳酸菌發(fā)酵后的水果和蔬菜飲料中新產(chǎn)生的乳酸使產(chǎn)品增加了柔和爽口的酸味[12-14]。截至目前，毛酸漿乳酸菌發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。

本研究擬采用6種不同乳酸菌對(duì)毛酸漿進(jìn)行發(fā)酵，比較發(fā)酵過(guò)程中總酸含量、乳酸菌活菌數(shù)和色澤的變化，為研發(fā)出一種新型毛酸漿乳酸菌發(fā)酵飲料提供依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步拓展毛酸漿的加工途徑有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

毛酸漿果：黑龍江省大慶市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 菌株

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（L1）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）（L2）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）（L3）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（L4）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）（L5）、干酪乳桿菌（Lacbobacillus casei）（L6）：中國(guó)工業(yè)微生物種保藏中心。

1.1.3 試劑

白糖（食品級(jí)）：黑龍江北方糖業(yè)股份有限公司；Pectinex XXL果膠酶（10 000 U/mL）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HR7633打漿機(jī)：飛利浦家庭電器（珠海）有限公司；WS108手持式折光儀：河北潤(rùn)聯(lián)科技開(kāi)發(fā)有限公司；TD5Z臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DL-CJ-1N超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；CR-410型色差儀：日本柯尼卡美能達(dá)公司；EX324電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；BX43-OLYMPUS顯微鏡：奧林巴斯有限公司；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 毛酸漿乳酸菌發(fā)酵

毛酸漿果汁的制備：選取成熟度好、粒大飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)霉變的毛酸漿鮮果，去除萼片，清水洗滌后于90 ℃熱燙5 min，打漿后備用。打漿后的毛酸漿按2.0 mL/kg加入Pectinex XXL果膠酶，將其置于45 ℃水浴中酶解4 h[15]。用白糖直接調(diào)糖度至21%。將調(diào)完糖度的果汁經(jīng)85 ℃處理10 min后，冷卻至室溫，備用。

菌種活化：將乳酸菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃活化培養(yǎng)24 h。

毛酸漿乳酸菌發(fā)酵：按3%（V/V）的接種量將活化好的乳酸菌接種于毛酸漿果汁中，在37 ℃條件下恒溫發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中取樣，測(cè)定總酸含量、活菌數(shù)和色澤的變化。

1.3.2 單一乳酸菌發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)

分別將已活化好的乳酸菌L1、L2、L3、L4、L5、L6，按照3%（V/V）的接種量接種于毛酸漿果汁中，37 ℃條件下恒溫發(fā)酵，每天取樣，測(cè)定總酸含量和乳酸菌活菌總數(shù)，并比較發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的色差值，比較各乳酸菌的發(fā)酵特性。

1.3.3 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)

在單一菌發(fā)酵試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選出發(fā)酵結(jié)果較好的3株乳酸菌L4、L5、L6，將乳酸菌L4、L5和L6兩兩組合，其組合比例見(jiàn)表1，接種總量為3%，分別接種到毛酸漿果汁中，在37 ℃下恒溫發(fā)酵。每12 h取樣，測(cè)定總酸含量和乳酸菌活菌數(shù)，并比較發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的色差值，選出乳酸菌的最佳配比。

表1 復(fù)合乳酸菌組合配比方案Table 1 Combination scheme of compound lactic acid bacteria

1.3.4 測(cè)定方法

總酸含量[16]：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》酸堿滴定法進(jìn)行測(cè)定。

乳酸菌菌落總數(shù)[17]：參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》測(cè)定，結(jié)果以每毫升發(fā)酵液中所含活菌菌落的對(duì)數(shù)表示，即Lg（CFU/mL）[18]。

色澤：按照朱丹等[19]的方法測(cè)定，采用美能達(dá)CR-410型色差儀測(cè)定各發(fā)酵液的亮度（L*值）、紅綠值（a*值）、黃藍(lán)值（b*值），計(jì)算色差值（ΔE值），其計(jì)算如公式如下：

式中：L0、a0、b0表示標(biāo)準(zhǔn)白板的讀數(shù)；L*值表示亮度，L*值越高表明樣品表面越白；a*＞0表示紅值、a*＜0表示綠值；b*＞0表示黃值、b*＜0表示藍(lán)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一乳酸菌發(fā)酵毛酸漿

2.1.1 單一乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化

毛酸漿果汁經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化Table 2 Changes of total acid contents during the fermentation by different lactic acid bacterium

由表2可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，L1、L2、L33株乳酸菌發(fā)酵液中總酸含量較低，均＜4.80 g/L，產(chǎn)酸效果不好；而接種L4、L5、L63株乳酸菌的發(fā)酵液中總酸含量不斷累積，發(fā)酵前4天變化較大，發(fā)酵7 d后基本穩(wěn)定。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乳酸菌L4、L5、L6發(fā)酵液中的總酸含量較高，其中，乳酸菌L4發(fā)酵液中總酸含量最高，為11.85 g/L。

2.1.2 單一乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化

不同乳酸菌發(fā)酵毛酸漿過(guò)程中活菌數(shù)的變化結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化Table 3 Changes of viable count during the fermentation by different lactic acid bacterium

由表3可知，經(jīng)過(guò)活化的乳酸菌接入到毛酸漿果汁后，除乳酸菌L1外，其他各菌株在新的生長(zhǎng)環(huán)境中遲滯期較短，不斷生長(zhǎng)繁殖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在第3天進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，并且各乳酸菌的菌落總數(shù)均達(dá)到最大值。至第8天發(fā)酵結(jié)束時(shí)，由于發(fā)酵液中的總酸含量較高，菌體出現(xiàn)衰老死亡現(xiàn)象，活菌數(shù)略有下降。其中，乳酸菌L4、L5、L6的活菌數(shù)相對(duì)較高。

2.1.3 單一乳酸菌發(fā)酵后對(duì)毛酸漿發(fā)酵液色澤的影響

不同乳酸菌發(fā)酵毛酸漿，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液色澤的變化結(jié)果見(jiàn)表4。亮度（L*值）、紅綠值（a*值）、黃藍(lán)值（b*值）、色差值（ΔE值）是觀測(cè)果蔬制品顏色變化的常用參數(shù)[20]。

表4 不同乳酸菌發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液色值測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of color value of fermentation broth after fermentation by different lactic acid bacterium

由表4可知，發(fā)酵結(jié)束后，與未接種乳酸菌的毛酸漿果汁（空白）相比，各發(fā)酵液的L*值均變小、ΔE值均變大，說(shuō)明各發(fā)酵液顏色均變暗；乳酸菌L1、L2、L3發(fā)酵液的a*、b*值變化較大，發(fā)酵液顏色更趨近于紅色，而乳酸菌L4、L5、L6發(fā)酵液的變化相對(duì)較小，說(shuō)明發(fā)酵液更趨近于黃色。因此，乳酸菌L4、L5、L6能更好地保持發(fā)酵果實(shí)本身的顏色，其色澤更利于人們接受。綜上所述，選擇L4、L5、L63株乳酸菌進(jìn)行后續(xù)的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵。

2.2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵毛酸漿

2.2.1 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化

將發(fā)酵效果較好的植物乳桿菌（L4）、短乳桿菌（L5）、干酪乳桿菌（L6）3株乳酸菌按不同比例接種到毛酸漿中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵毛酸漿過(guò)程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，毛酸漿的總酸含量不斷上升。各復(fù)合乳酸菌發(fā)酵液的總酸含量均在發(fā)酵0～72 h上升速度較快，在發(fā)酵84 h逐漸趨于穩(wěn)定。發(fā)酵結(jié)束后，乳酸菌L4與L6按照不同比例組合時(shí)，其總酸含量顯然高于其他菌種比例，且乳酸菌L4∶L6為3∶2（V/V）時(shí)，毛酸漿發(fā)酵液中總酸含量最高，可達(dá)到17.91 g/L，比單一乳酸菌L4發(fā)酵時(shí)的總酸含量（11.85 g/L）高6.06 g/L。顯然，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵明顯優(yōu)于單一乳酸菌發(fā)酵。

表5 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化Table 5 Changes of total acid contents during the fermentation by compound lactic acid bacteria

續(xù)表

2.2.2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化

植物乳桿菌（L4）、短乳桿菌（L5）、干酪乳桿菌（L6）3株乳酸菌按不同比例接種到毛酸漿果汁中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化Table 6 Changes of viable count during the fermentation by compound lactic acid bacteria

續(xù)表

由表6可知，不同比例的乳酸菌接入毛酸漿中后，乳酸菌利用發(fā)酵基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷代謝繁殖，與這3株單一乳酸菌生長(zhǎng)結(jié)果相似，遲滯期較短。發(fā)酵0～60 h時(shí)，復(fù)合乳酸菌相繼進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在第72 小時(shí)菌落總數(shù)達(dá)到最大；發(fā)酵至108 h后，乳酸菌開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，由于發(fā)酵液中的總酸含量較高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，菌體出現(xiàn)衰老和死亡現(xiàn)象，活菌數(shù)開(kāi)始下降，按不同比例接種乳酸菌發(fā)酵的毛酸漿樣品間差異不大。

2.2.3 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵后對(duì)毛酸漿發(fā)酵液色澤的影響

植物乳桿菌（L4）、短乳桿菌（L5）、干酪乳桿菌（L6）3株乳酸菌按不同比例接種到毛酸漿中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液色澤的變化結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液色值測(cè)定結(jié)果Table 7 Determination results of color value of fermentation broth after fermentation by compound lactic acid bacteria

續(xù)表

由表7可知，與未接種乳酸菌的毛酸漿果汁空白對(duì)照相比，在發(fā)酵結(jié)束后，各種處理的發(fā)酵液L*值均變小，ΔE值均變大，說(shuō)明各種處理的發(fā)酵液顏色變化趨勢(shì)相似，即復(fù)合乳酸菌發(fā)酵后對(duì)毛酸漿發(fā)酵液色澤的影響基本一致。

3 討論

近年來(lái)，隨著乳酸菌研究的深入和在發(fā)酵果蔬汁應(yīng)用的不斷增多，發(fā)現(xiàn)各種乳酸菌在不同果汁中發(fā)酵特性存在明顯差異。劉欣等[18]研究顯示，植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）發(fā)酵荔枝汁48 h時(shí)活菌數(shù)最高，達(dá)9.0 lg（CFU/mL）；嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）在荔枝汁發(fā)酵液中活菌數(shù)略低，為8.0 lg（CFU/mL）；而嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的活菌數(shù)最低，為7.0 lg（CFU/mL），顯著低于其他乳酸菌活菌數(shù)（P＜0.05）。發(fā)酵中不同菌株發(fā)酵荔枝汁的酸度均呈上升趨勢(shì)，其中，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、嗜熱鏈球菌和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）發(fā)酵荔枝汁的酸度較低，短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的酸度最高，為140.9°T，顯著高于其他發(fā)酵液的酸度。陳曉維等[14]研究不同乳酸菌在冬瓜汁中的發(fā)酵特性表明，干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌（Bifidobacteria）在開(kāi)始發(fā)酵8 h時(shí)生長(zhǎng)緩慢，嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）等4種乳酸菌的生長(zhǎng)速率接近。此外，干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌于30 ℃發(fā)酵40 h時(shí)，冬瓜汁中可滴定酸和色差值均呈上升趨勢(shì)。束文秀等[21]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌在胡柚汁中生長(zhǎng)良好，活菌數(shù)＞8.0 lg（CFU/mL），pH值顯著降低，酸度顯著提高，L*值呈下降趨勢(shì)，a*值、b*值呈上升趨勢(shì)。本試驗(yàn)中6種乳酸菌在毛酸漿汁中繁殖能力較好，乳酸菌活菌數(shù)均能穩(wěn)定維持在8.0 lg（CFU/mL）以上，但是，僅植物乳桿菌（L4）、短乳桿菌（L5）和干酪乳桿菌（L6）的產(chǎn)酸量較高；嗜熱鏈球菌（L1）、保加利亞乳桿菌（L2）和瑞士乳桿菌（L3）在毛酸漿果汁中生長(zhǎng)速率較慢，產(chǎn)酸效果較差，發(fā)酵液的色差值ΔE較高。該結(jié)果與上述劉欣等[18，14，21]的研究結(jié)果不完全一致，說(shuō)明在不同的果汁中，各種乳酸菌的適應(yīng)性和發(fā)酵性能存在較大的差異。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)6種不同乳酸菌在毛酸漿中發(fā)酵特性的比較可知，6種乳酸菌在毛酸漿汁中繁殖能力較好，乳酸菌活菌數(shù)均能穩(wěn)定維持在8.0 lg（CFU/mL）以上，其中，嗜熱鏈球菌（L1）、保加利亞乳桿菌（L2）和瑞士乳桿菌（L3）在毛酸漿汁中產(chǎn)酸效果較差，總酸含量均＜4.80 g/L，發(fā)酵液ΔE值均＞56.48，更趨近于紅色；而植物乳桿菌（L4）、短乳桿菌（L5）和干酪乳桿菌（L6）在毛酸漿汁中的活菌數(shù)和總酸含量相對(duì)較高，并且發(fā)酵液ΔE值均＜54.51，均能很好地保持發(fā)酵液本身的顏色。當(dāng)乳酸菌L4、L5和L6按不同組合比例接種到毛酸漿中發(fā)酵時(shí)，各處理間活菌數(shù)和發(fā)酵液顏色變化基本一致，當(dāng)乳酸菌L4∶L6為3∶2（V/V）時(shí)，最終毛酸漿發(fā)酵液的總酸含量最高，為17.91 g/L，明顯優(yōu)于單一乳酸菌以及其他復(fù)合乳酸菌的發(fā)酵結(jié)果。