翟 廳，丁 波，羅會(huì)東，王溪橋，劉紅娜*

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030；2.蘭州海關(guān)技術(shù)中心，甘肅蘭州 730010）

蛋乳發(fā)酵飲料是以新鮮雞蛋、牛奶為主要原料通過(guò)殺菌、發(fā)酵等一系列加工工藝制成的一種色澤淡黃、風(fēng)味獨(dú)特、組織細(xì)膩、營(yíng)養(yǎng)均衡的飲料[1]。雞蛋消化率在95%以上，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-3]。牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富，是氨基酸、礦物質(zhì)以及維生素的良好來(lái)源[4]。以雞蛋全蛋液和脫脂牛乳為原料，經(jīng)干酪乳桿菌發(fā)酵制成蛋乳發(fā)酵飲料可使?fàn)I養(yǎng)更加均衡，更加容易被人體吸收。干酪乳桿菌可防止急性腹瀉和食物過(guò)敏，具有良好的耐酸性及膽汁抗性，具有降低膽固醇的作用[5-7]，適合各種人群飲用。

國(guó)外關(guān)于蛋乳發(fā)酵飲料的研究比較早，LIN J C C等[8]分別利用全蛋液和蛋清液與牛奶發(fā)酵研制出雞蛋酸酪乳，結(jié)果證明通過(guò)乳酸菌發(fā)酵蛋乳飲料開(kāi)發(fā)一種新產(chǎn)品是可行的。20世紀(jì)80年代，日本研制出了發(fā)酵蛋黃乳飲料、發(fā)酵蛋清乳飲料以及發(fā)酵全蛋液乳飲料等各種花色發(fā)酵蛋乳飲料[9]。我國(guó)關(guān)于蛋乳發(fā)酵飲料研究主要集中在蛋液比例、糖原料、穩(wěn)定劑配比、所選用的微生物菌種[10-15]。目前，以保加利亞乳桿菌（Lactobncillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）制備蛋乳發(fā)酵飲料的研究較多[16-19]，但市場(chǎng)上普通乳酸菌飲料不能滿足人們需求。本研究以新鮮雞蛋和脫脂牛乳粉為原料，采用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵一款新型蛋乳飲料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化制備蛋乳發(fā)酵飲料工藝條件，并對(duì)蛋乳發(fā)酵飲料進(jìn)行理化成分品質(zhì)評(píng)價(jià)，旨在增加發(fā)酵乳花色飲料新品種，為雞蛋的加工提供新的方法，也為蛋乳發(fā)酵飲料的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋（蘭州興盛養(yǎng)殖場(chǎng)）：市售；脫脂牛乳粉：恒天然商貿(mào)責(zé)任有限公司；氫氧化鈉、乙醇、石油醚、硼酸、氨水、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、酚酞、甲基紅、次甲基藍(lán)（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；MRS平板培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；干酪乳桿菌：從市售養(yǎng)樂(lè)多中分離純化，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：中國(guó)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SG2型酸度計(jì)：中國(guó)梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；DHG-9241A型電熱恒溫干燥箱：中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KND-04型自動(dòng)凱氏定氮儀：中國(guó)上海纖檢儀器有限公司；HOI-IB型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：中國(guó)上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；VS-840K超凈工作臺(tái)：中國(guó)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-30SII高壓蒸汽滅菌鍋：中國(guó)西安常儀生化科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋乳發(fā)酵飲料的制備工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

全蛋液滅菌：新鮮雞蛋放入體積分?jǐn)?shù)為75%酒精中浸泡10 min進(jìn)行滅菌，打蛋后加入蔗糖攪勻，并將糖蛋液置于水浴鍋中60 ℃、30 min巴氏殺菌。

脫脂牛乳滅菌：121 ℃滅菌20 min。

混合、冷卻：60 ℃時(shí)將蛋乳液混合均勻，冷卻至37 ℃。

調(diào)節(jié)pH：調(diào)節(jié)蛋乳液pH值為6.8。

接種：在MRS平板培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，之后挑取單個(gè)的干酪乳桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，擴(kuò)大培養(yǎng)至脫脂乳試管。按1%～5%的比例進(jìn)行接種。

發(fā)酵：于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h（pH值達(dá)到4.6）。

后熟：4 ℃冷藏12 h，即得蛋乳發(fā)酵飲料。

1.3.2 蛋乳發(fā)酵飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

研究發(fā)酵時(shí)間分別為12 h、15 h、18 h、21 h、24 h對(duì)蛋乳飲料感官評(píng)分、酸度、沉淀率的影響；蛋液添加量為2%、4%、6%、8%、10%對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料感官評(píng)分、酸度、沉淀率的影響；脫脂奶粉添加量為2%、4%、6%、8%、10%對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料感官評(píng)分、酸度、沉淀率的影響；接種量為1%、2%、3%、4%、5%對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料感官評(píng)分、酸度、沉淀率的影響；蔗糖添加量為2%、4%、6%、8%、10%對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料感官評(píng)分、酸度、沉淀率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以全蛋液添加量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、干酪乳桿菌接種量（C）為影響因素，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken tests design

1.3.4 感官評(píng)價(jià)方法

感官評(píng)價(jià)由實(shí)驗(yàn)室10位專業(yè)人員（5男5女）組成評(píng)定小組，按照表2的標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)色澤、香味滋味、組織狀態(tài)、口感4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。在評(píng)定前對(duì)評(píng)定人員進(jìn)行培訓(xùn)，取約50 mL蛋乳發(fā)酵飲料試樣于無(wú)色透明的容器中，置于光亮處，迎光觀察色澤和組織狀態(tài)，并在室溫條件下品嘗滋味、嗅其氣味[15]。采用描述性分析對(duì)發(fā)酵飲料的質(zhì)地特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿分100分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2[19]。

表2 蛋乳發(fā)酵飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fermented egg-milk beverage

1.3.5 理化指標(biāo)的測(cè)定

酸度：參照參考文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行測(cè)定；穩(wěn)定性：參照參考文獻(xiàn)[21]的方法進(jìn)行測(cè)定，其中沉淀率=沉淀物質(zhì)量/10 mL蛋乳飲料質(zhì)量×100%，沉淀率越大表明其穩(wěn)定性越差；脂肪：參照參考文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)：參照參考文獻(xiàn)[23]的方法進(jìn)行測(cè)定；pH值的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 微生物指標(biāo)的測(cè)定

乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定方法參照國(guó)標(biāo)GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》的平板計(jì)數(shù)法[25-26]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，同時(shí)用Duncan's法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋乳發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋乳發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

由圖1可知，發(fā)酵時(shí)間在12～24 h范圍內(nèi)，發(fā)酵蛋乳飲料的感官評(píng)分先增大后減小，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為18 h時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為83.6分，沉淀率為0.176%，穩(wěn)定性最高，酸度為73.6°T。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在12～18 h時(shí)，干酪乳桿菌產(chǎn)酸量少，雞蛋蛋腥味較重，甜度較大，組織狀態(tài)稀疏；發(fā)酵時(shí)間＞18 h之后，酸味過(guò)重，掩蓋了蛋乳的香味，糖酸比例失衡，組織狀態(tài)粗糙，有顆粒狀沉淀，影響口感。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為18 h。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different fermentation time on fermented egg-milk beverage quality

2.1.2 不同全蛋液添加量對(duì)蛋乳發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

在蛋乳發(fā)酵飲料中，蛋液添加量多少直接影響發(fā)酵產(chǎn)品的口感和風(fēng)味，蛋液含量少產(chǎn)品會(huì)缺乏特征風(fēng)味；而蛋液含量多容易凝固。由圖2可知，全蛋液添加量在2%～10%范圍內(nèi)，發(fā)酵蛋乳飲料的感官評(píng)分先增大后減小，蛋液添加量為6%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為83.7分，沉淀率最小為0.302%，穩(wěn)定性最高，酸度為73.7 °T。當(dāng)?shù)耙禾砑恿吭?%～6%時(shí)，牛奶味掩蓋住雞蛋味，品嘗不出雞蛋的香味，破壞穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，易產(chǎn)生沉淀；當(dāng)?shù)耙禾砑恿浚?%之后，蛋腥味過(guò)大導(dǎo)致感官評(píng)分下降。因此，選擇最佳蛋液添加量為6%。

圖2 不同全蛋液添加量對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different whole egg liquid additions on fermented egg-milk beverage quality

2.1.3 不同脫脂奶粉添加量對(duì)蛋乳發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

圖3 不同脫脂奶粉添加量對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different skimmed milk additions on fermented egg-milk beverage quality

由圖3可知，脫脂奶粉添加量在6%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為77.7分，沉淀率最小為0.163%，穩(wěn)定性最高，酸度為52.3°T。脫脂奶粉的添加量對(duì)酸度影響較小。當(dāng)脫脂奶粉添加量為2%～6%時(shí)，雞蛋腥味較重，當(dāng)脫脂奶粉添加量＞6%之后，又因?yàn)橐桩a(chǎn)生沉淀，蛋味過(guò)輕，導(dǎo)致感官評(píng)分下降。因此，選擇最佳脫脂奶粉添加量為6%。

2.1.4 不同接種量對(duì)蛋乳發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

由圖4可知，接種量在1%～5%范圍內(nèi)，發(fā)酵蛋乳飲料的感官評(píng)分先增大后減小。沉淀率先減小后增大。接種量在3%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為83.1分，沉淀率最小為0.151%，穩(wěn)定性最高，酸度為69.3 °T。接種量為1%～3%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸的速度快，易產(chǎn)生沉淀，口感差，產(chǎn)品組織狀態(tài)差，因此評(píng)分較低。當(dāng)接種量＞3%之后，接種量偏大，導(dǎo)致發(fā)酵飲料酸味過(guò)重，掩蓋住牛奶和雞蛋香味，糖酸比例失衡，形成小顆粒凝乳，影響口感，最終導(dǎo)致評(píng)分下降。因此，選擇最佳接種量為3%。

圖4 不同接種量對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料品質(zhì)的影響Fig.4 Effects of different inoculum on fermented egg-milk beverage quality

2.1.5 不同蔗糖添加量對(duì)蛋乳發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響

由圖5可知，蔗糖添加量在2%～10%范圍內(nèi)，蔗糖添加量為6%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為81.4分，沉淀率最小為0.221%，穩(wěn)定性達(dá)到最高，酸度為98.6°T。當(dāng)蔗糖添加量＜6%之前，甜度較低，發(fā)酵完成后酸味過(guò)重，破壞產(chǎn)品穩(wěn)定結(jié)構(gòu)易產(chǎn)生沉淀，且掩蓋住雞蛋和牛奶的風(fēng)味。當(dāng)蔗糖添加量＞6%之后，穩(wěn)定性差，感官評(píng)分下降。因此，選擇最佳蔗糖添加量為6%。

圖5 不同蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵蛋乳飲料品質(zhì)的影響Fig.5 Effects of different sucrose addition on fermented egg-milk beverage quality

2.2 蛋乳發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以全蛋液添加量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、干酪乳桿菌接種量（C）為影響因素（通過(guò)單因素試驗(yàn)蔗糖添加量與脫脂奶粉添加量對(duì)感官評(píng)分無(wú)顯著影響故舍去），以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

根據(jù)表3試驗(yàn)結(jié)果建立模型，采用逐步回歸的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸分析，得到關(guān)于感官評(píng)分對(duì)全蛋液添加量、發(fā)酵時(shí)間以及接種量的二次回歸方程：Y=73.46+2.50A-2.40B-5.05C+3.67AB+2.08AC+0.43BC-5.84A2-7.84B2-5.09C2

由表4可知，回歸模型的F值為14.08，P＜0.01，差異極顯著；失擬項(xiàng)F值為2.87，P=0.167 4＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，即模型擬合程度較好，進(jìn)一步說(shuō)明模型變異程度較小。通過(guò)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)該模型的決定系數(shù)R2=0.947 7，變異系數(shù)為4.22%，模型變異較小。一次項(xiàng)A、B、交互項(xiàng)AB對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；一次項(xiàng)C、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.01）。綜上所得，該模型能對(duì)蛋乳發(fā)酵飲料工藝進(jìn)行分析和優(yōu)化模擬。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Benhnken tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

蛋液添加量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和接種量（C）3個(gè)因素的交互作用的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6。

圖6 全蛋液添加量、發(fā)酵時(shí)間及接種量對(duì)蛋乳發(fā)酵飲料感官評(píng)價(jià)影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between whole egg liquid addition,fermentation time and inoculum on sensory evaluation of fermented egg milk-beverage

由圖6A可知，從其橢圓形圖可以直觀的看出隨著全蛋液添加量的提高，感官評(píng)分先上升后下降，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，感官評(píng)分也是先上升后下降，等高線圖呈橢圓形，由回歸分析可知全蛋液添加量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用顯著。由曲面坡度的陡峭情況可知，全蛋液添加量的曲面比發(fā)酵時(shí)間的曲面更陡，說(shuō)明全蛋液添加量對(duì)感官得分影響更加顯著。

由圖6B可知，從其橢圓形圖可以直觀的看出隨著全蛋液添加量的提高，感官評(píng)分先上升后下降，隨著接種量的增加，感官評(píng)分也是先上升后下降，等高線圖呈橢圓形。由回歸分析可知全蛋液添加量和接種量的協(xié)同作用不顯著。由曲面坡度的陡峭情況可知，接種量的曲面比全蛋液添加量的曲面更陡，說(shuō)明接種量對(duì)感官得分影響更加顯著。

由圖6C可知，從其橢圓形圖可以直觀的看出隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，感官評(píng)分先上升后下降，隨著接種量的增加，感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)。等高線圖呈橢圓形，由回歸分析可知發(fā)酵時(shí)間和接種量的協(xié)同作用不顯著。由曲面坡度的陡峭情況可知，接種量的曲面比發(fā)酵時(shí)間的曲面更陡，說(shuō)明接種量對(duì)感官得分影響更加顯著。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，得到最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間17 h、接種量2.02%、全蛋液添加量6.32%。為方便實(shí)際操作，修改工藝條件為發(fā)酵時(shí)間17 h、接種量2%、全蛋液添加量6%，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評(píng)分實(shí)際值為91.6分，與理論值90.36分接近，說(shuō)明采用響應(yīng)面優(yōu)化的生產(chǎn)工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，按照建立的模型進(jìn)行試驗(yàn)在實(shí)踐中是可行的。

2.4 蛋乳發(fā)酵飲料產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)

表5 蛋乳發(fā)酵飲料的質(zhì)量指標(biāo)Table 5 Quality indexes of fermented egg-milk beverage

由表5可知，此條件下的蛋乳發(fā)酵飲料感官上具有特殊的發(fā)酵香味和酸味，無(wú)蛋腥味，呈均勻乳黃色有光澤的乳飲料。經(jīng)測(cè)定發(fā)酵蛋乳飲料中蛋白質(zhì)含量為3.40%、脂肪含量為1.60%、酸度為70°T。乳酸菌活菌總數(shù)＞106CFU/mL。結(jié)果表明，感官指標(biāo)、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)均滿足GB/T 21732—2008《含乳飲料》中相關(guān)指標(biāo)要求[27]。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定蛋乳發(fā)酵飲料的最佳工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間17 h，全蛋液添加量6.3%、接種量2.0%，在此優(yōu)化工藝條件下，蛋乳發(fā)酵飲料感官評(píng)分為91.6分，顏色均勻呈淡黃色，組織細(xì)膩，有發(fā)酵飲料特有的發(fā)酵香味和滋味。蛋白質(zhì)含量為3.40%、脂肪含量1.60%、酸度為70°T、pH值為4.45，乳酸菌活菌數(shù)＞106CFU/mL，蛋乳發(fā)酵飲料營(yíng)養(yǎng)均衡、風(fēng)味獨(dú)特，有較好的研究?jī)r(jià)值和發(fā)展前景。