馬艷莉，席曉麗，李大偉，梁靜靜，李素萍，丁玉峰，王 頡，郭書賢

（1.南陽理工學(xué)院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南南陽 473004；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071000）

青方腐乳又名青腐乳，俗稱臭豆腐，是腐乳的一大類[1]。它是以大豆為主要原料，在后期發(fā)酵過程中，加低度鹽水湯料釀制而成的表里顏色呈青色或豆青色的腐乳，其具有刺激性的臭味，但臭里透香[2-3]，最有名的是北京王致和臭豆腐。由于青方腐乳發(fā)酵后使一部分蛋白質(zhì)的硫氫基和氨基游離出來產(chǎn)生了以硫化物氣味為主的臭味，所以青方的風(fēng)味很容易被感覺到[1，4]。與其他類型相比，青方腐乳蛋白質(zhì)分解較徹底，氨基酸含量豐富，特別是青方腐乳中含有較多的丙氨酸，有獨特的甜味和酯香味[1，3]。

青方腐乳作為一種富含蛋白質(zhì)的佐餐制品，經(jīng)長期發(fā)酵很容易產(chǎn)生生物胺。生物胺是一類含氮低分子質(zhì)量化合物的總稱[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，生物胺廣泛存在于各種食品中，尤其是富含蛋白質(zhì)及氨基酸的強化食品和發(fā)酵食品，常見的主要有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺等[6]。微量生物胺是生物體內(nèi)的正常生理成分，在機體中發(fā)揮著重要的作用。高濃度的生物胺不僅會影響食品風(fēng)味甚至改變其成分[7]，人體一旦攝入過量的生物胺，尤其是多種生物胺同時攝入，會引起中毒、心悸、惡心、呼吸紊亂、高血壓等癥狀，嚴(yán)重時還會危及生命[8-9]。有關(guān)生物胺的報道表明，組胺對人體健康影響最大，8～40 mg就會輕微中毒，超過100 mg就會產(chǎn)生嚴(yán)重中毒反應(yīng)，甚至?xí)霈F(xiàn)休克。酪胺的毒性僅次于組胺，超過100 mg會出現(xiàn)偏頭痛等癥狀[10-11]。目前，有關(guān)腐乳中生物胺的報道大部分集中在工藝條件對其含量的影響、產(chǎn)生物胺菌株的鑒定以及檢測方法以及腐乳的功能性作用方面。而關(guān)于腐乳開蓋后貯藏過程中生物胺的研究報道較少。QIUS等[12-13]研究了在腐乳成熟期添加乙醇對生物胺含量的影響，發(fā)現(xiàn)添加乙醇對實驗室制得的腐乳生物胺總量有降低作用。TSAI Y H等[14]對臺灣地區(qū)22個腐乳樣品中組胺含量以及合成組胺的微生物進行了研究，發(fā)現(xiàn)枯草桿菌菌種可以合成組胺，但合成能力較低。劉振峰等[15]采用高效液相色譜法檢測了中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中的10種生物胺，發(fā)現(xiàn)不同樣品的生物胺含量差異很大。食品中生物胺的測定分析方法主要有薄層色譜法[16]、氣相色譜法[17]、離子色譜法[18]、毛細(xì)血管電泳法[19]和高效液相色譜法[20]等，其中高效液相色譜法檢測靈敏度高，重現(xiàn)性好，是測定生物胺含量的有效方法。本實驗青方腐乳生物胺的測定采用高效液相色譜法。

腐乳開蓋后易受微生物污染，可能存在生物胺超標(biāo)的風(fēng)險。本試驗選取了同一生產(chǎn)日期同一品牌的市售青方腐乳，研究開蓋后貯藏在不同溫度下其生物胺含量、水分活度（water activity，Aw）、pH、氨基酸態(tài)氮的動態(tài)變化，探討生物胺與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期為青方腐乳食用安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

青方腐乳（同一生產(chǎn)日期同一品牌）：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

腐胺、色胺、組胺、苯乙胺、精胺、酪胺、尸胺和亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞97%）：美國Sigma-Aldrich試劑有限公司；乙腈（色譜純）：上海Merck試劑有限公司；丹磺酰氯（純度≥98%）：上海麥克林試劑有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；丙酮、濃鹽酸（37%）、氨水、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、乙酸銨、甲醛（38%）、氯化鈉（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

610L真空冷凍干燥機：新陽速凍設(shè)備制造有限公司；2695型高效液相色譜儀：美國Waters儀器有限公司；Eclipse XDB-C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國Agilent儀器有限公司；CP214電子分析天平：奧斯豪儀器上海有限公司；5424R高速冷凍離心機：上海力申科學(xué)儀器有限公司；XHF-DY攪拌分離器：上海奧克斯儀器有限公司；QL-861渦旋機：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；STARTER2100酸度計：寧波新芝生物科技有限公司；Novasina CH-8533水分活度測定儀：瑞士步琦有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

將購買的8瓶青方腐乳開蓋后分別在4 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃條件下各放兩瓶，之后在0、15 d、30 d、45 d、60 d取樣測定生物胺含量、水分活度、pH和氨基酸態(tài)氮含量等指標(biāo)。

1.3.2 生物胺的測定

青方腐乳生物胺的測定采用高效液相色譜法，具體操作參照李大偉等[20]的方法。

1.3.3 理化指標(biāo)的測定

（1）水分活度的測定

水分活度（Aw）用水分活度測定儀進行測定，具體操作如下：在溫度18～25 ℃，相對濕度50%～80%的條件下，用飽和鹽溶液校正水分活度儀，稱取約1 g（精確至0.01 g）試樣，迅速放入樣品皿中，封閉測量倉，每隔5 min記錄水分活度儀的響應(yīng)值。當(dāng)相鄰兩次響應(yīng)值之差＜0.005時，即為Aw測定值。待儀器充分平衡后，同一樣品重復(fù)測定3次。

（2）pH的測定

pH的測定參照劉振鋒[21]的方法并作部分修改，稱5.0 g樣品于50 mL離心管中，加20 mL去離子水利用均質(zhì)機分散均質(zhì)，然后4 ℃、3 600×g條件下離心25 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用去離子水定容后取出40 mL，用pH計直接測量，每個樣品重復(fù)檢測3次。

（3）氨基酸態(tài)氮含量的測定

氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）含量的測定參照行標(biāo)SB/T 10170—2007《腐乳》[22]中的方法進行。

1.3.4 相關(guān)性分析

水分活度、pH、溫度等可以通過影響微生物繁殖以及酶系的活性進而影響生物胺的合成。因此，理化指標(biāo)與生物胺之間存在一定的聯(lián)系。本實驗將所得的生物胺含量和理化指標(biāo)的數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析，選擇雙變量，用Pearson相關(guān)系數(shù)以P值在0.05水平下具有統(tǒng)計學(xué)意義來確定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 22.0分析，數(shù)據(jù)方差分析（analysis of variance，ANOVA）及其差異顯著性分析使用Duncan多重比較，繪圖使用Origin8.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度對青方腐乳生物胺的影響

溫度對生物胺的產(chǎn)生有重要的影響，孟勇等[23]研究不同貯藏溫度對中華絨螯蟹生物胺的影響時發(fā)現(xiàn)，溫度越高，生物胺產(chǎn)生速度越快。青方腐乳開蓋后在不同溫度下貯藏時，生物胺的含量測定結(jié)果見表1。由表1可知，貯藏溫度對不同生物胺的含量變化有不同影響。隨開蓋貯藏時間的延長，色胺、苯乙胺、腐胺和酪胺的變化規(guī)律類似，呈先升高后降低趨勢，尸胺呈先升高后降低再升高的趨勢。不同貯藏溫度下，剛開蓋的青方腐乳中未檢測到精胺和亞精胺。剛開蓋時，組胺含量均＜100 mg/kg，貯藏15 d時組胺含量均＞100 mg/kg，超過了美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）對水產(chǎn)中組胺的推薦限量值＜50 mg/kg[24]，有可能會出現(xiàn)中毒癥狀。青方腐乳酪胺含量在不同溫度條件下貯藏至30 d（除25 ℃第30天）時，酪胺含量均＞100 mg/kg。貯藏前30 d，隨著貯藏時間的延長，25 ℃和35 ℃貯藏的青方腐乳，苯乙胺含量比4 ℃和15 ℃的要高，說明苯乙胺形成的適宜溫度在25～35 ℃。貯藏前中期（0～30 d）的組胺在25 ℃和35 ℃含量增長較快；貯藏后期（30～60 d）組胺含量降低?？赡苁怯捎谖⑸锏奈廴緦?dǎo)致pH的降低，抑制了酶的活性，也有可能是腐乳在貯藏后期水解的組氨酸含量降低。

表1 市售青方腐乳樣品開蓋后在不同溫度下貯藏生物胺含量的變化Table 1 Changes of biogenic amine contents of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid

綜上所述，從食用安全角度考慮，腐乳開蓋后盡量在15 d之內(nèi)食用完。從本次試驗結(jié)果來看，即使在4 ℃貯藏的條件下，在第15天也可能存在組胺中毒的現(xiàn)象。

2.2 不同貯藏溫度下理化指標(biāo)的動態(tài)變化

2.2.1 不同溫度下貯藏水分活度的動態(tài)變化

對不同溫度貯藏的青腐乳水分活度變化進行測定，結(jié)果見圖1。由圖1可知，4 ℃貯藏的青方腐乳Aw呈先上升后下降在上升的趨勢，15 ℃貯藏的青方腐乳Aw一直處于緩慢上升的趨勢。在25 ℃和35℃貯藏的青方腐乳Aw的變化趨勢相一致，都是先下降后上升在下降的趨勢。在整個貯藏過程中，青腐乳4種不同貯藏溫度條件下Aw均＞0.84，微生物能夠生長繁殖，可能產(chǎn)生脫羧酶。

圖1 市售青方腐乳樣品開蓋后不同溫度下貯藏水分活度的變化Fig.1 Changes of water activity of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid

2.2.2 不同溫度下貯藏pH的動態(tài)變化

測定不同貯藏溫度下的青方腐乳pH，結(jié)果見圖2。由圖2可知，15 ℃、25 ℃、35 ℃貯藏的開蓋青方腐乳pH在整個貯藏期變化規(guī)律基本一致，且都在貯藏第15天pH達(dá)到最大值，說明不同貯藏溫度對青方腐乳pH變化規(guī)律影響不大，青方腐乳貯藏15 d時pH達(dá)最大值，可能是由于微生物分泌蛋白酶的作用，將蛋白質(zhì)降解為氨基酸，隨后進一步脫氨基產(chǎn)生氨，導(dǎo)致pH 值明顯上升，貯藏15 d后pH 值有下降趨勢，可能是由于酸性氨基酸增加、有機酸產(chǎn)生等引起總酸含量升高。35 ℃貯藏的腐乳pH均高于25 ℃貯藏的腐乳，這與35 ℃貯藏的腐乳總胺含量高于25 ℃貯藏的腐乳相一致。腐乳貯藏過程中pH的動態(tài)變化，也側(cè)面反應(yīng)出腐乳生物胺的動態(tài)變化。受試青方腐乳的pH均在7.0～7.7之間，可能是青方腐乳中氨類含量較高，或是蛋白質(zhì)過度水解使生物胺等堿類物質(zhì)含量增加。

圖2 市售青方腐乳樣品開蓋后不同貯藏溫度下pH值的變化Fig.2 Changes of pH value of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid

2.2.3 不同溫度下貯藏氨基酸態(tài)氮的動態(tài)變化

不同溫度下貯藏，青方腐乳氨基酸態(tài)氮的動態(tài)變化結(jié)果見圖3。

由圖3可知，4 ℃、15 ℃、25 ℃貯藏的青方腐乳開蓋開始時AAN含量差異不顯著，但在其整個貯藏過程中，AAN含量變化規(guī)律不同，4 ℃貯藏的青方腐乳AAN含量在整個貯藏過程中一直處于上升狀態(tài)且在第60天達(dá)到最大值（0.54 g/100 g）；15 ℃貯藏的青方腐乳AAN含量先升高后降低再升高，在第30天達(dá)到最大值（0.537 g/100 g）；25 ℃貯藏的青方腐乳AAN含量在整個貯藏過程中變化規(guī)律和15 ℃貯藏的腐乳變化規(guī)律相一致，但在第60天達(dá)到最大值。在貯藏的前15 d，貯藏溫度越高，氨基酸態(tài)氮增加越快。貯藏過程中AAN含量的變化一定程度上也可反映總胺含量的動態(tài)變化。

圖3 市售青方腐乳樣品開蓋后不同溫度貯藏條件下氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of amino acid nitrogen contents of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid

2.3 生物胺與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

生物胺與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性用SPSS 22.0進行分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，pH值與苯乙胺、尸胺、組胺和亞精胺呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；水分活度與所測的8種生物胺無顯著的相關(guān)性（P＞0.05）；腐胺與色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺和精胺呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；色胺與苯乙胺、尸胺呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。發(fā)酵食品中產(chǎn)生的瓜氨酸能在不同酶的作用下合成腐胺的前體物質(zhì)精氨酸和鳥氨酸，而腐胺是精胺和亞精胺的前體物質(zhì)；有文獻(xiàn)報道，胍基丁胺的存在也能誘導(dǎo)微生物合成腐胺，而組胺和酪胺能影響胍基丁胺的合成，從而影響到腐胺的合成[25]，所以可能是不同的生物胺之間存在轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論

通過研究貯藏溫度對市售青方腐乳開蓋后生物胺的影響，初步明確青方腐乳在四種溫度下貯藏至第15天時，苯乙胺和組胺含量分別超過30 mg/kg和100 mg/kg（即FDA的推薦的限量值），可能會產(chǎn)生一定的安全風(fēng)險。各種生物胺與理化指標(biāo)存在一定的相關(guān)性，說明Aw、pH和氨基酸態(tài)氮的變化也可從側(cè)面反映出總胺含量的動態(tài)變化。目前，我國對食品中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)大部分是關(guān)于魚類組胺的，腐乳中的生物胺含量還未有標(biāo)準(zhǔn)限定。就此試驗結(jié)果來看，青方腐乳開蓋后即使在4 ℃貯藏，在第15天也可能存在組胺和苯乙胺中毒的風(fēng)險為了食用安全，腐乳開蓋后應(yīng)盡量在15 d內(nèi)食用完。