常甜甜，李記明，阮仕立，沈志毅，李 超，姜東琪，李施瑤，范民婷，劉曉露，畢蕓杰，趙玉平*

（1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264003；2.煙臺張裕集團有限公司山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，山東煙臺 264001）

早在兩千多年前，高盧地區(qū)（Gaul）的人們便用橡木桶儲存和運輸啤酒，而后羅馬帝國士兵發(fā)現(xiàn)橡木桶擁有輕便和易運輸?shù)葍?yōu)勢，便開始使用橡木桶來盛放葡萄酒，隨后橡木桶陳釀葡萄酒的好處被人們漸漸發(fā)掘出來。許多經(jīng)過橡木桶陳釀的葡萄酒就好像經(jīng)過打磨的玉石，紋理層次的細膩感都更上一層樓。

橡木桶用于葡萄酒陳釀，存在于橡木桶中的揮發(fā)酚、呋喃醛、萜類、單寧、橡木內(nèi)酯等由于溶解、浸漬等作用進入到葡萄酒中，增加了酒的風(fēng)味復(fù)雜性；還可以防止因帶菌皮而引起酒的過分還原，同時，由于控制氧化的發(fā)生而導(dǎo)致紅葡萄酒澀味降低，顏色增強、穩(wěn)定性提高[1]。目前，出于成本的考慮，出現(xiàn)了一些可替代的辦法，包括添加橡木片、橡木塊和微氧技術(shù)，創(chuàng)造一個近似于橡木桶的環(huán)境來貯藏葡萄酒，進行葡萄酒的陳釀。國內(nèi)外有很多關(guān)于橡木桶對葡萄酒陳釀過程的研究。劉濤等[2]總結(jié)了橡木桶儲藏對葡萄酒質(zhì)量的影響因素，提出了橡木桶貯藏過程中對葡萄酒造成不愉快味道的主要成分是乙烯基苯酚類物質(zhì)；提出橡木桶和酵母酒泥對葡萄酒香味成分吸附作用及葡萄酒陳釀的系列新技術(shù)。張美玲等[3-4]就橡木桶對葡萄酒陳釀中有機酸、花色苷、白藜蘆醇等物質(zhì)的影響也進行了報道。位于法國的歐洲化學(xué)和生物研究院的Quidea 及其研究小組稱橡木紅酒擁有一種可以有效抗腫瘤的多酚物質(zhì)—acutissimin A。要產(chǎn)生這種物質(zhì)，需要來自橡木的櫟木鞣花素（vescalagin）和來自葡萄中的兒茶酸或表兒茶酸。在研究中發(fā)現(xiàn)，acutissimin A比一種臨床上用來治療睪丸癌和肺癌的抗癌藥物依托泊苷（4-去甲基表鬼臼毒素-β-D乙叉吡喃葡萄糖苷）的有效率強250倍。其潛在抗癌能力可能來自于它能夠抑制DNA逆轉(zhuǎn)錄酶II的活性。葡萄酒除去含有酒精和糖分之外，還含有像花青素、白藜蘆醇、單寧、氨基酸、維生素以及微量元素等營養(yǎng)成分，紅酒中保存了葡萄皮中的多酚類物質(zhì)，多酚類物質(zhì)具有很強的抗氧化、抗炎的作用，對人體的心腦血管具有保健作用，減少血液中的低密度脂蛋白，降低血液的凝固性，從而降低心梗、中風(fēng)發(fā)生的風(fēng)險，還能預(yù)防組織器官的老化。日常飲用一點葡萄酒對人的身體大有益處，關(guān)于葡萄酒中酚類物質(zhì)和抗氧化活性的研究也有大量報道[5-6]。

目前，2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazo-line-6-sulfonic acid），ABTS）方法常用來評價一些抗氧化物的抗氧化性，即根據(jù)待測化合物清除ABTS自由基引起的吸光度值變化來評價其抗氧化活性，抗氧化性常與待測樣品的濃度和反應(yīng)時間有關(guān)，因此，確定恰當?shù)臋z測反應(yīng)條件對提高結(jié)果準確性意義重大。本實驗主要研究了橡木桶陳釀對紅葡萄酒抗氧化活性和酚類物質(zhì)含量的影響，比較ABTS方法測定經(jīng)橡木桶陳釀和未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒抗氧化性的反應(yīng)條件上的差異，并確定最適反應(yīng)條件，以提高檢測效率和準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品分為經(jīng)橡木桶陳釀和未經(jīng)陳釀兩大類，包括赤霞珠、蛇龍珠、黑比諾、西拉、美樂五個品種，均由張裕公司提供。各供試葡萄酒樣品信息見表1。

表1 供試葡萄酒樣品信息Table 1 Information of tested wine samples

續(xù)表

ABTS：山東西亞化學(xué)股份有限公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）：上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸、福林酚和蕓香葉苷·三水：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP64電子天平：上海庚庚儀器設(shè)備有限公司；UV/VIS紫外可見分光光度計：珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；Multiskan FC型酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總酚、花色苷、黃烷醇含量的測定

總酚含量的測定是參照ODEYEMI S等[7-8]的方法，以沒食子酸為標準，采用福林酚法測定；花色苷的測定是參照LUCENA A P S等[9]的pH示差法，總花色苷含量以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計；總黃酮含量的測定是以蘆丁為標準的方法進行測定的[10]。所有樣品重復(fù)三次，最終數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤差”來表示。

1.3.2 ABTS法測定紅葡萄酒抗氧化活性反應(yīng)條件的確定

葡萄酒抗氧化性的測定參考李華等[12]的方法。

（1）Trolox標準品的配制：用甲醇配制1 mmol/L的Trolox標準儲備液，并將其稀釋為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L的不同濃度梯度，使其具有10%～90%的自由基清除能力。

（2）反應(yīng)液的配制：用pH 4.5醋酸緩沖液分別配制濃度為7 mmol/L ABTS溶液和濃度為2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，并于0～4 ℃避光保存。取等體積的ABTS溶液和過硫酸鉀溶液混合為母液，室溫避光反應(yīng)12～16 h備用。量取1.40 mL ABTS母液，用pH 4.5 醋酸緩沖液稀釋至32 mL，室溫避光放置0.5 h后，于波長734 nm測定其吸光度值為0.74±0.03。

（3）葡萄酒樣品的稀釋：在經(jīng)橡木桶陳釀和未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒樣品中，分別選擇每個品種的一個葡萄酒樣品，將其用蒸餾水稀釋成若干濃度，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒樣品的稀釋比例（葡萄酒樣品體積與稀釋后總體積之比）為5∶1 000～6∶100，經(jīng)橡木桶陳釀的為5∶1 000～4.5∶100。

（4）樣品及Trolox的測定方法：參考李媛媛等[11]的方法。待試樣品為選取的干紅葡萄酒的各個稀釋比例的稀釋液，反應(yīng)時間為0～300 min。在96孔板中依次加入200 μL ABTS工作液和10 μL不同濃度的樣品溶液和Trolox溶液，搖勻，室溫下動態(tài)測定波長734 nm處的吸光度值A(chǔ)（n=3）。空白組用pH4.5醋酸緩沖液代替ABTS工作液，對照組用甲醇代替樣品溶液?？寡趸钚杂肨rolox等價抗氧化能力（troloxequivalentantioxidantcapacity，TEAC）值表示，單位為mmol/L。

1.3.3 最佳反應(yīng)時間和最佳稀釋比例的確定

分析反應(yīng)動力學(xué)曲線以確定最佳反應(yīng)時間范圍，在確定好的反應(yīng)時間下，不同稀釋比例的紅葡萄酒樣品與ABTS工作液反應(yīng)，若稀釋比例在某一區(qū)間內(nèi)與測定的吸光度值或ABTS自由基清除率之間線性相關(guān)，此區(qū)間的稀釋比例即為紅葡萄酒的最佳稀釋比例范圍。

公眾對轉(zhuǎn)基因食品的態(tài)度。在我國，民眾對轉(zhuǎn)基因食品還存在比較高的質(zhì)疑，一方面主要是轉(zhuǎn)基因的技術(shù)相對不夠成熟，存在著許多未知因素，人們對轉(zhuǎn)基因食品的疑慮還難以消除；另一方面是人們對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在認知水平上有一定的界限，以及對公眾機構(gòu)體制機制的信任度下降，導(dǎo)致對轉(zhuǎn)基因存在著安全疑慮，接受程度相對較低。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、計算和分析。試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳反應(yīng)時間的確定

未經(jīng)陳釀和經(jīng)陳釀的紅酒對ABTS自由基清除活性的影響見圖1和圖2。在反應(yīng)初期20 min時，樣品的自由基清除能力有一個快速的提升，這說明，在反應(yīng)剛開始時，由于物質(zhì)濃度較大，化學(xué)反應(yīng)速率較快；在反應(yīng)后期，自由基清除率減幅逐漸變小，反應(yīng)速率逐漸降低后趨于平穩(wěn)。另外，對于抗氧化性相對較高的葡萄品種來說，高濃度的樣品與ABTS自由基反應(yīng)迅速，短時間內(nèi)就已經(jīng)反應(yīng)完全。

圖1 未經(jīng)陳釀的紅酒對ABTS自由基清除活性隨時間的變化Fig.1 Changes of ABTS free radical scavenging activities of unaged red wines with time

由圖1可知，對于未經(jīng)陳釀的紅酒來說，不同稀釋比例的紅葡萄酒樣品反應(yīng)220～260 min時，其ABTS自由基清除率的線性趨勢均很明顯，如紅葡萄酒的稀釋比例為3∶100時，蛇龍珠、赤霞珠、美樂和黑比諾ABTS自由基清除率的線性R2分別為0.994 3，0.993 7，0.996 5和0.995 1，即紅葡萄酒中的抗氧化物質(zhì)清除ABTS+的速率在220～260 min時基本趨于穩(wěn)定，這一時間段的測定值可以反應(yīng)紅葡萄酒酒樣的本征抗氧化性。同時，由圖1分析得到，反應(yīng)220 min、240 min和260 min時的TEAC值差異不大。因此，將220～260 min視為酶標儀-ABTS方法測定未經(jīng)橡木桶陳釀紅葡萄酒抗氧化活性的最佳反應(yīng)時間范圍，具體的反應(yīng)時間可根據(jù)待測樣品的數(shù)量酌情選擇。

圖2 經(jīng)陳釀的紅酒對ABTS自由基清除活性隨時間的變化Fig.2 Changes of ABTS free radical scavenging activities of aged red wines with time

由圖2可知，對于經(jīng)過陳釀的紅葡萄酒來說，不同稀釋比例的紅葡萄酒在反應(yīng)進行到240～280 min時，ABTS自由基清除率的線性趨勢明顯，如紅葡萄酒的稀釋比例為2.5∶100時，蛇龍珠、赤霞珠、美樂和西拉四種紅葡萄酒的自由基清除率的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.994 8，0.994 1，0.997 2，0.996 1，表示紅葡萄酒的自由基清除率在240～280 min時基本趨于穩(wěn)定，且240 min、260 min和280 min時TEAC值差異不大，因此，經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒的抗氧化活性測定時間范圍為240～280 min。通過比較未經(jīng)橡木桶陳釀和經(jīng)橡木桶陳釀的紅酒的最佳反應(yīng)時間范圍發(fā)現(xiàn)，二者在最佳反應(yīng)時間上差別不大。

2.2 最佳稀釋比例的確定

以不同稀釋比例的葡萄酒反應(yīng)240 min為例，葡萄酒樣品的不同稀釋比例對ABTS自由基清除率的影響見圖3。

圖3 不同稀釋比例葡萄酒樣品對ABTS自由基清除活性的影響Fig.3 Effect of wine samples dilution ratio on ABTS free radical scavenging activities

由圖3A可知，對于未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒來說，蛇龍珠、赤霞珠、美樂、黑比諾紅葡萄酒的稀釋比例分別為3∶100～5∶100（圖A中為3～5）、2.5∶100～4.5∶100、3∶100～4∶100和2.5∶100～4∶100時，線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999 8、0.997 6、0.999 4、0.995 0，說明不同品種葡萄酒樣品在一定的稀釋比例范圍內(nèi)與自由基清除率有明顯的線性趨勢。因此，為了滿足所有品種紅葡萄酒的測試要求，選擇3∶100～4∶100為酶標儀-ABTS方法測定未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒的抗氧化活性的最佳稀釋比例范圍。

由圖3B可知，蛇龍珠、赤霞珠兩種紅葡萄酒的稀釋比例為1∶100～2∶100（圖B中為1～2）時，美樂和西拉的稀釋比例分別為0.5∶100～2∶100和0.5∶100～2.5∶100時，稀釋比例與自由基清除率的線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999 0和0.998 3，0.997 6和0.997 0。為滿足不同品種紅葡萄酒的測試要求，選擇1∶100～2∶100為酶標儀-ABTS方法測定經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒抗氧化性的最佳稀釋比例范圍。

通過比較未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒和經(jīng)陳釀的紅葡萄酒的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者在測定的最佳稀釋比例上存在差異，未經(jīng)橡木桶處理的紅酒的最佳稀釋比例范圍為3∶100～4∶100，而經(jīng)橡木桶陳釀的紅酒的稀釋比例在1∶100～2∶100范圍內(nèi)，與ABTS自由基清除率的線性關(guān)系更好。

2.3 酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性大小比較與分析

實驗所得Trolox對ABTS自由基清除率的標準曲線回歸方程為y=91.422x+3.744，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。表示在0.1～0.9 mmol/L范圍內(nèi)，Trolox的濃度與自由基清除率線性關(guān)系良好。

根據(jù)2.1和2.2確定的反應(yīng)條件，測定所有紅葡萄酒樣品的抗氧化性，結(jié)果用TEAC值表示，實驗反應(yīng)條件為：未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒樣的稀釋比例選擇3.5∶100，反應(yīng)時間為260 min；經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒樣的稀釋比例為2∶100，反應(yīng)時間為260 min。紅葡萄酒樣品的酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性結(jié)果見表2。

表2 供試葡萄酒樣品的酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力Table 2 Phenolic substances contents and antioxidant capacity of tested wine samples

圖4 供試葡萄酒樣品的酚類物質(zhì)含量和抗氧化性Fig.4 Phenolic substances contents and antioxidant capacity of tested wine samples

葡萄酒的酚類成分取決于葡萄品種、葡萄園環(huán)境因素、葡萄酒的加工工藝、成熟過程中的土壤和大氣條件以及陳化過程等[13]。由表2可知，未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒樣品中，不同品種紅葡萄酒的總酚、花色苷、總黃酮含量和抗氧化活性大小按照赤霞珠＞美樂＞蛇龍珠＞黑比諾的順序依次遞減。陜西的美樂葡萄酒具有最高的總酚含量，2 533.42 mg/L，和抗氧化活性，TEAC值高達27.82 mmol/L。來自寧夏銀川的黑比諾R1和煙臺的蛇龍珠葡萄酒R3在酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性上都表現(xiàn)較低水平。

經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒中，陜西的樣品R13具有最高的總酚（3214.86 mg/L）、花色苷（27.22 mg/L）、總黃酮（96.95 mg/L）含量和TEAC值（42.41 mmol/L），其總酚含量和TEAC值是新疆西拉葡萄酒的2倍。其次是北京的兩個赤霞珠紅葡萄酒（R14和R15）和煙臺的蛇龍珠葡萄酒。通過比較煙臺R7和陜西R8兩個地區(qū)的美樂葡萄酒發(fā)現(xiàn)，樣品R8在酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性上都要高于樣品R7，這與地區(qū)特殊的地理位置和氣候條件有關(guān)[14]。

由表2和圖4可知，橡木桶陳釀對紅葡萄酒酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性有影響。未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒樣品無論是酚類物質(zhì)含量，還是能表示抗氧化能力的TEAC值都要低于經(jīng)過橡木桶陳釀的紅葡萄酒，經(jīng)橡木桶陳釀過的紅葡萄酒的酚類物質(zhì)含量比未經(jīng)橡木桶處理的紅葡萄酒高12%，經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒的花色苷含量均值達17.75 mg/L，是未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒的2倍，總黃酮含量高16%，TEAC值高28%，但是經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒樣品的總酚含量相較于未經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒樣品分布更加分散。同為煙臺產(chǎn)區(qū)的蛇龍珠，經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒R9-R12在總酚、花色苷、黃酮含量和TEAC值都要高于未經(jīng)橡木桶陳釀的樣品R2和R3。

更多的，由表2分析可以看出，酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性TEAC值之間存在著正相關(guān)的關(guān)系，這說明，酚類物質(zhì)的積累使得紅葡萄酒具有更高的抗氧化能力，這與大量文獻中報道的結(jié)果一致[15-18]。然而，也并不排除不同種類的酚類物質(zhì)之間的協(xié)同作用的可能性，通過比較樣品R9、R14、R15、R16、R17發(fā)現(xiàn)，花色苷含量的降低，抗氧化活性并沒有隨之降低，相似的實驗結(jié)果在ZAFRILLA P等[19]的報道中也曾提及。紅葡萄酒中還存在著維生素和礦物質(zhì)等許多其他生物活性化合物，他們的協(xié)同作用也可能與紅葡萄酒的自由基清除能力有關(guān)。高品質(zhì)的紅葡萄酒一般需要一段時間的陳釀，在此期間，天然葡萄酚類中發(fā)生氧化、水解和其他轉(zhuǎn)化作用。橡木桶中紅酒的老化是一種昂貴的做法，因此，它也暗示了巨大的成本[20]，因此添加橡木片也成為葡萄酒陳化的一種方式。相關(guān)研究報道，隨著陳化時間的延長，酚酸和兒茶素含量降低，而黃酮、花青素和高分子量原花青素含量增加，抗氧化活性與橡木片切片用量和陳化時間有關(guān)[21]。

3 結(jié)論

應(yīng)用酶標儀，采用ABTS方法動態(tài)監(jiān)測未經(jīng)橡木桶陳釀和經(jīng)橡木桶陳釀的兩類紅葡萄酒的反應(yīng)過程，以確定適合檢測的最佳反應(yīng)條件。試驗所得適合未經(jīng)橡木桶陳釀的葡萄酒的最佳反應(yīng)時間范圍為220～260 min，最佳樣品稀釋比例范圍為3∶100～4∶100，經(jīng)橡木桶陳釀的紅葡萄酒抗氧化活性的最佳反應(yīng)時間范圍是240～280 min，最佳稀釋比例范圍為1∶100～2∶100。此外，結(jié)果還表明經(jīng)橡木桶陳釀過的紅酒具有更高的酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性，因此橡木桶陳釀對紅葡萄酒品質(zhì)的提高具有積極作用。本試驗建立的酶標儀微型ABTS方法測定紅酒抗氧化活性的方法，操作簡單，樣品消耗量少，效率高，可同時測定多個樣品。葡萄酒在橡木桶中的陳釀是一個復(fù)雜的過程，其變化依賴于諸多因素，因此，許多方面還需要更進一步的研究。