廖劍橋，雷宏杰，黃 豪，姜 甜，徐懷德*

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214000）

啤酒是一種歷史悠久的釀造酒，以麥芽、水為原料，添加酒花及其他輔料，經(jīng)啤酒酵母釀制而成。啤酒營養(yǎng)豐富，酒精含量低，故有“液體面包”之稱[1]。啤酒高濃釀造技術是采用高濃麥汁（麥汁濃度＞16°P）進行發(fā)酵，再以富含CO2的脫氧水稀釋至規(guī)定酒精度[2]，具有提高設備利用率，提高啤酒產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本以及節(jié)約能源和勞動力，提高啤酒生物及非生物穩(wěn)定性，提高輔料利用率，增加每單位可發(fā)酵物的乙醇產(chǎn)量等優(yōu)點[2-3]。但是，啤酒高濃釀造也面臨著一些問題，如發(fā)酵時間長導致酵母細胞壓力增大，泡沫穩(wěn)定性降低，風味變差以及酒花利用率降低等[2]。除此之外，在啤酒高濃釀造過程中，酵母還面臨著更為嚴苛的環(huán)境條件，如發(fā)酵前期的高滲透壓和發(fā)酵后期的高乙醇毒性等。研究表明，乙醇對酵母細胞生長具有強烈的抑制作用[4]。乙醇可干擾酵母細胞膜脂組織，擾亂膜轉運蛋白的構象和功能，增加質(zhì)膜通透性[5-6]；高濃度的乙醇會干擾酵母細胞壁的正常功能，抑制細胞的生長及乙醇的進一步生成[7-8]。游離氨基氮（free amino nitrogen，F(xiàn)AN），是能夠被酵母同化利用的含氮物質(zhì)，包括游離氨基酸、銨離子與小分子肽等[9]。FAN的缺乏是啤酒高濃釀造中導致酵母適應環(huán)境脅迫能力變差的主要原因，氮源嚴重缺乏甚至會導致發(fā)酵停滯[10]。為了解決這些問題，前人已經(jīng)提出了多種方法，如補充氨基酸與肽[11]，添加大豆活性肽[12]、小麥面筋水解物[13]，或添加蛋白酶以增加麥汁中FAN水平[2]。在高濃麥汁中添加氮源被證明是一種有效的方法。

由于堿性氨基酸與支鏈氨基酸是酵母細胞生長所必需的氨基酸，細胞無法自身合成，只能靠從外界環(huán)境中攝取，而氮源缺乏是高濃麥汁的主要缺陷。因此，為了探究這六種氨基酸對啤酒高濃釀造過程中酵母生理特性和發(fā)酵性能的影響，本研究通過在高濃麥汁中分別添加六種氨基酸：精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile），研究其對酵母生長和活細胞率、麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量、啤酒風味物質(zhì)形成的影響，為啤酒高濃釀造工業(yè)生產(chǎn)中氮源的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

Lager啤酒酵母（Saccharomyces pastorianus）：安琪酵母股份有限公司；大麥芽：廈門市老啤匠貿(mào)易有限公司；酒花顆粒：西安雪花啤酒有限公司；麥芽糖漿：江蘇先卓食品科技股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）：北京索萊寶科技有限公司；亞甲基藍：天津博迪化工股份有限公司；KH2PO4、Na2HPO4·12H2O：廣東光華科技股份有限公司；2-辛醇：范德（北京）生物科技有限公司。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LRN-250CL低溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；PAL-1數(shù)字手持袖珍折射儀：日本ATAGO（愛宕）公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；GL-10MD大容量高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；E100LED MV生物顯微鏡：日本尼康公司；DMA 35安東帕便攜式密度計：奧地利安東帕有限公司；UV1780紫外-可見分光光度計：日本島津公司；QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高濃麥汁制備

在任璐等[14]的方法上調(diào)整原麥汁制備工藝參數(shù)。麥芽經(jīng)粉碎后，以1∶4（g∶mL）的料液比，加入45 ℃蒸餾水進行攪拌、糖化，糖化條件：45 ℃，30 min；63 ℃，60 min；72 ℃，10 min；78 ℃，10 min，以1 ℃/min的速率升溫。糖化結束后，將原麥汁冷卻至約45 ℃過濾，將濾液煮沸并保持沸騰狀態(tài)90 min。在麥汁沸騰過程中添加所用麥芽質(zhì)量0.2%的酒花顆粒，采用三次添加法[15]進行酒花顆粒添加：煮沸10 min時添加酒花總量的10%，35 min時添加55%，煮沸結束前10min加入剩余35%酒花。煮沸結束后趁熱過濾，加入蒸餾水將原麥汁濃度調(diào)整至12°P，再加入麥芽糖漿，調(diào)整至24°P，形成高濃麥汁。裝瓶，進行高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）。

1.3.2 啤酒發(fā)酵

接種酵母前，在無菌條件下，向高濃麥汁中分別添加六種氨基酸：Arg、His、Lys、Val、Leu、Ile，添加量為400 mg/L。對照組中不添加任何氨基酸（對照組中三種堿性氨基酸Arg、Lys、His的含量分別為406 mg/L、134 mg/L、213 mg/L，三種支鏈氨基酸Val、Leu、Ile的含量分別為343mg/L、471mg/L、209 mg/L）?；钚愿山湍附?jīng)活化后，加入高濃麥汁中，接種量為2 g/L。于12 ℃條件下進行發(fā)酵，每日搖瓶稱質(zhì)量。發(fā)酵結束后，離心（6 000 r/min，4 ℃，10 min），分別取酵母泥與上清液。上清液保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 酵母計數(shù)和活細胞率

將離心所得酵母泥稱質(zhì)量，再用血球計數(shù)板對酵母進行計數(shù)以及活細胞率的測定：將酵母泥用生理鹽水（0.9%NaCl溶液）以1∶100的比例進行稀釋后，在0.1 mL的細胞懸浮液中加入0.9 mL磷酸亞甲基藍溶液（pH=4.6），振蕩混勻，靜置染色10 min后，在顯微鏡下通過血球計數(shù)板對活細胞和死細胞進行計數(shù)，其中，死亡的細胞會被亞甲基藍染成藍色?；罴毎视嬎愎饺缦拢?/p>

1.3.4 麥汁發(fā)酵度

使用附溫比重瓶法測定發(fā)酵前后麥汁濃度：將上清液緩慢倒入25 mL附溫比重瓶中，插入溫度計，避免產(chǎn)生氣泡，準確稱量其在20 ℃條件下的質(zhì)量，同樣方法測出蒸餾水在20 ℃條件下的質(zhì)量。根據(jù)二者比值，查比重和浸出物質(zhì)量百分含量對照表得出麥汁在20 ℃條件下浸出物含量，以°P表示。麥汁發(fā)酵度計算公式如下：

1.3.5 酒精度測定

取上清液與蒸餾水各50 mL，一并加入蒸餾燒瓶中進行蒸餾，用容量瓶準確收集50 mL餾出液。再用安東帕便攜式密度計直接測定讀取酒精度，以體積分數(shù)表示%vol。

1.3.6 風味物質(zhì)測定

使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定啤酒中的風味物質(zhì)，采用與常婷婷[16]相同的條件進行分析：在20 mL頂空瓶中加入6 mL樣品和1.5 g NaCl，以及20 mg/mL的2-辛醇標準溶液20 μL，此時樣品中2-辛醇實際質(zhì)量濃度為66.7 μg/mL，加蓋密封后進行測定分析。未知化合物經(jīng)計算機檢索同時與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）和Wileylibrary數(shù)據(jù)庫相匹配，保留SI＞85的結果，所得風味物質(zhì)為相對于內(nèi)標的含量。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-1 ms 毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始柱溫：40 ℃；進樣口溫度230 ℃；程序升溫：40 ℃保持3 min，然后以4 ℃/min 速度升到120 ℃，再以6 ℃/min 升到240 ℃，保持9 min；載氣為氦氣（He），流速1.0 mL/min；不分流進樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70eV，質(zhì)量掃描范圍35～400amu。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

每組實驗重復3次，采用Minitab 18（Minitab Inc.）進行數(shù)據(jù)分析，采用Fisher最小顯著差別（least significant difference，LSD）法進行顯著性分析。其中，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。使用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 添加不同氨基酸對啤酒高濃釀造過程中CO2失質(zhì)量的影響

由圖1可知，發(fā)酵開始的第1天，各組CO2失質(zhì)量均較低，發(fā)酵非常緩慢，是細胞適應環(huán)境的過程。從第2天開始，CO2失質(zhì)量增加，曲線斜率增大。由于麥汁中營養(yǎng)物質(zhì)充足，酵母細胞得以快速繁殖，參與發(fā)酵的酵母數(shù)量急劇增加，無氧發(fā)酵活躍。各組CO2失質(zhì)量在第3天為最大，其中Val組高達17.2 g/L。隨后，總CO2失質(zhì)量趨于穩(wěn)定，酵母細胞進入穩(wěn)定期，在此期間，代謝產(chǎn)物逐漸積累增多，當CO2失質(zhì)量趨于平穩(wěn)時，乙醇的產(chǎn)量也趨于穩(wěn)定，因此，在細胞進入衰亡期前、總CO2失質(zhì)量趨于穩(wěn)定時，終止發(fā)酵。

圖1 發(fā)酵期間各組CO2質(zhì)量損失Fig.1 CO2 mass loss of each group during fermentation

發(fā)酵開始至第5天，各組間CO2失質(zhì)量差異顯著（P＜0.05），直至發(fā)酵結束，對照組CO2失質(zhì)量（87.7 g/L）低于所有添加氨基酸的實驗組。Arg組發(fā)酵前5 d CO2失質(zhì)量一直高于其他組。從第6天開始至發(fā)酵結束，添加Val、Leu與Arg的實驗組CO2失質(zhì)量始終高于其他組，分別為92.4 g/L、92.7 g/L與91.2 g/L。結果表明，高濃麥汁中添加堿性氨基酸及支鏈氨基酸可顯著提高Lager酵母的發(fā)酵速率及發(fā)酵活力（P＜0.05）。其中，Arg、Val以及Leu效果優(yōu)于其他3種氨基酸。

2.2 添加不同氨基酸對酵母細胞生長和活細胞率的影響

啤酒高濃釀造過程中添加大豆蛋白酶解物，可增強酵母的乙醇耐受性、滲透壓耐受性，改善細胞的代謝環(huán)境，提高酵母凈增長量[12]。由圖2可知，Arg的添加對酵母細胞的生長促進效果最好，達1.64×108cells/mL，顯著高于對照組（1.33×108cells/mL）（P＜0.05）。CHENG Y等[17]的研究表明，Arg具有保護酵母細胞免受乙醇脅迫的作用，可以促進細胞在乙醇脅迫下的生長。其他氨基酸的添加對酵母細胞的生長無顯著影響。

圖2 發(fā)酵結束時各組酵母總細胞數(shù)Fig.2 Total yeast cells number of each group at the end of fermentation

由圖3可知，His添加組的活細胞率顯著高于對照組（P＜0.05），達82.69%，而對照組僅為76.77%。明明[18]研究表明，在培養(yǎng)基中添加乙醇，對酵母菌的細胞生長有抑制作用，尤其在高濃度時的抑制作用更強。其余各氨基酸添加組的活細胞率與對照組無顯著差異（P＞0.05），但是，由于各組乙醇產(chǎn)量均顯著高于對照組乙醇產(chǎn)量（P＜0.05），因此，各組在發(fā)酵結束時面臨更嚴峻的環(huán)境脅迫。而添加各氨基酸的實驗組能在乙醇產(chǎn)量較對照組更高的情況下，保持酵母總細胞數(shù)以及活細胞率與對照組相當?shù)乃?，甚至更?yōu)（Arg、His添加組），表明在高濃釀造中添加這六種氨基酸可以顯著增強酵母細胞對乙醇的耐受性，保證酵母細胞的生長繁殖及存活率。在實際工業(yè)生產(chǎn)中，更高的酵母總細胞數(shù)及活細胞率，有利于酵母的重復利用。

圖3 發(fā)酵結束時各組酵母活細胞率Fig.3 Yeast cell viability of each group at the end of fermentation

2.3 添加不同氨基酸對麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量的影響

由圖4可知，發(fā)酵結束時，各實驗組發(fā)酵度從高到低依次為：Val＞Leu＞Arg＞Ile＞Lys＞His＞對照組。高濃麥汁中由于加入了大量幾乎不含氮的麥芽糖漿，導致其中FAN水平降低。低水平的FAN會導致酵母增殖緩慢，使發(fā)酵滯緩甚至停滯[19-20]。對照組發(fā)酵度最低，為79.29%。麥汁中充足的FAN可以確保酵母細胞快速增殖，從而保證良好的發(fā)酵性能，在常濃釀造過程中，F(xiàn)AN水平與酵母生長成正比，在高濃釀造中，則需要更高水平的FAN以保證發(fā)酵能正常進行。因此，各添加氨基酸的實驗組，發(fā)酵度均極顯著高于未添加任何氮源物質(zhì)的對照組（P＜0.01），其中Val組發(fā)酵度最高，為83.65%，其次為添加Leu和Arg的實驗組，分別為82.95%、82.93%。這與YANG H等[11]的實驗結果一致。

圖4 添加不同氨基酸對各組麥汁發(fā)酵度的影響Fig.4 Effect of different amino acids supplementations on wort fermentation degree of each group

高濃麥汁中可發(fā)酵糖含量高，因此在發(fā)酵后期會產(chǎn)生更多的乙醇。然而，酒精作為酵母細胞的代謝產(chǎn)物，反過來會抑制乙醇的生成，這種抑制效果較常濃釀造時的抑制效果更為強烈。TANO M等[21]實驗表明，外源添加乙醇會導致甘蔗汁發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量降低。此外，某些氨基酸缺陷型菌株（即自身不能合成相應的氨基酸）對乙醇更為敏感：與色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸代謝相關基因的缺失菌株對8%乙醇敏感[22]。若能夠提高酵母細胞對乙醇的耐受性，則有利于緩解乙醇對酵母的抑制作用：一些氨基酸積累型突變菌株則對外界的環(huán)境脅迫，包括乙醇脅迫等，表現(xiàn)出更強的耐受性[23-25]。

由圖5可知，添加六種氨基酸的實驗組，在發(fā)酵結束時，乙醇產(chǎn)量均極顯著高于對照組（P＜0.01），其中添加Val、Leu、Arg的實驗組乙醇產(chǎn)量最高，分別為11.97%（V/V）、11.90%（V/V）及11.83%（V/V），且三者之間無顯著差異（P＞0.05），對照組乙醇產(chǎn)量最低，僅為11.30%。乙醇產(chǎn)量與發(fā)酵度呈現(xiàn)出相同的趨勢，這表明酵母發(fā)酵利用麥汁中糖的程度，與產(chǎn)生乙醇的能力呈正相關性，即發(fā)酵度越高，對糖的消耗利用越充分，相應產(chǎn)生乙醇的量就越多。發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量的提高，對于實際生產(chǎn)具有重要的意義：在使用相同原料量的情況下，添加氨基酸可促進酵母對原料的充分利用，避免浪費，并且可以提高乙醇產(chǎn)量，增加產(chǎn)能。

圖5 添加不同氨基酸對各組乙醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different amino acids supplementations on ethanol yield of each group

2.4 添加不同氨基酸對啤酒風味物質(zhì)的影響

表1 添加不同氨基酸對各組啤酒風味物質(zhì)組成的影響Table 1 Effect of different amino acids supplementations on the composition of beer flavor of each group

由表1可知，Leu組乙酸異戊酯的含量大幅升高，導致其總酯的含量也大幅升高，Val組的總酯含量有所降低，其他各氨基酸添加組的酯類含量與對照組無顯著差異（P＞0.05），但是對高級醇的含量卻有較大影響：Lys添加組的總高級醇含量較對照組有所較低，僅為129.60 mg/L，此外，堿性氨基酸對啤酒的風味物質(zhì)并無太大影響。氨基酸在酵母細胞內(nèi)進行分解代謝，通過Ehrlich途徑生成少一個碳原子的高級醇，即Val、Leu、Ile分別是異丁醇、異戊醇及活性戊醇的前體物質(zhì)。三種支鏈氨基酸對高級醇含量影響最為明顯：Val組異丁醇含量較其他組明顯升高，高達21.53 mg/L。甄會英等[26-27]研究結果均表明，添加Val會顯著提升葡萄酒或山楂酒中異丁醇的含量，與本實驗結果一致。Leu組異戊醇含量遠高于其他實驗組，為196.62 mg/L，由于異戊醇含量的提高，導致乙酸異戊酯含量也有明顯的提高，達92.93 mg/L。醇酯比是指酒中高級醇與酯類含量的比例，能夠反映啤酒風味的協(xié)調(diào)程度，過高或者過低均對風味有不良影響，醇酯比在4左右時，啤酒的風味比較協(xié)調(diào)，且不易導致“上頭”[28-29]。因此，添加His、Val與Leu可提高醇酯比，對啤酒的風味有積極作用。

3 結論

在高濃釀造過程中添加Arg、Lys、His三種堿性氨基酸及Val、Leu、Ile三種支鏈氨基酸，可有效提高酵母發(fā)酵速率、酵母總細胞數(shù)及活細胞率。與對照組相比，添加該六種氨基酸，均能顯著提高麥汁發(fā)酵度，提高乙醇產(chǎn)量，其中，Val、Leu、Arg三種氨基酸效果最好。除Leu外其他五種氨基酸對酯類的含量無顯著影響，Lys可降低總高級醇含量，而Val、Leu、Ile三種支鏈氨基酸則分別大幅度增加了異丁醇、異戊醇及活性戊醇等高級醇的含量，Leu還極大地增加了乙酸異戊酯的含量。因此，在實際生產(chǎn)中，這六種氨基酸的添加可提高發(fā)酵速度，縮短生產(chǎn)周期，有利于酵母的重復使用，改善啤酒風味。本研究為啤酒高濃釀造工業(yè)生產(chǎn)中氮源的優(yōu)化提供了有力的理論支持。堿性氨基酸和支鏈氨基酸在細胞及分子水平上對酵母發(fā)酵性能的具體影響仍有待進一步研究。