孫利林，李立郎，胡 萍*，田 亞，麻穎垚，袁再順

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550014）

中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒的釀造微生物包括大曲、酒醅、窖泥和釀酒環(huán)境等四大微生物菌群[1]。不同菌群微生物在釀酒過程中的活動影響白酒的品質[2]。醬香型白酒在其獨特的釀造環(huán)境和工藝條件下，酒曲、酒醅、窖泥中形成了豐富的微生物資源[3]。這些微生物在醬香型白酒制曲和釀造過程中，扮演十分重要的角色，它不僅僅是釀酒原料的組成部分，還參與乙醇和香味物質的形成[4]。

細菌是醬香型白酒釀造過程中重要的產香功能微生物，具有分泌代謝降解蛋白質及淀粉的水解酶類，對酒體的風味質量有著極大的貢獻和關鍵調控作用[5]。高溫大曲中，細菌占絕對優(yōu)勢，有90%以上的數(shù)量，以獲得所需香味物質[6-8]。堆積發(fā)酵又稱“二次制曲”，是網(wǎng)羅堆積場地和空氣中的微生物進行堆積發(fā)酵，并生成多種酶類和多種酶類的相互作用下合成酒體的前驅物質及香味物質，為入窖發(fā)酵創(chuàng)造必要的條件，對醬香型白酒優(yōu)良酒質的形成起著關鍵性作用[9-12]。細菌及其代謝產物在高溫操作過程中強化了酒醅自身形成醬香的原動力，促進了醬香物質的進一步生成，研究最多的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）被認為是利用糖類和氨基酸促成“美拉德反應”而大量產生呈香物質的[13-14]。窖內發(fā)酵是堆積發(fā)酵的延續(xù)，將前者的代謝產物進行積累，利用窖產酸細菌（乳酸菌、醋酸菌等）成為主力，產酒精和二氧化碳的同時，也是酸類、酯類物質（乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等）形成的基礎[15]。石窖泥是醬香型白酒的特色發(fā)酵容器，窖泥中包含了大量的微生物，絕大部分為厭氧菌如厭氧菌乳桿菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）等[16]可以為釀酒提供豐富的風味物質（如丁酸、己酸和己酸乙酯等），窖泥對白酒中微量香味成分的形成及其量比關系的協(xié)調起著重要的作用，極大地影響著白酒釀造的品質[17]。

本研究采用高通量測序技術，利用Illumina公司Miseq測序平臺對醬香型白酒第四輪次酒釀造過程中高溫大曲、酒醅（堆積酒醅、窖內酒醅）以及窖泥進行研究，分析細菌微生物多樣性，群落結構特點、菌群組成的差異性以及各釀造階段的主要優(yōu)勢菌群動態(tài)變化規(guī)律，為優(yōu)化利用釀酒微生物和生產質量控制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒曲、酒醅（堆積酒醅、窖內酒醅）、窖泥樣品：采自貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)H酒廠和J酒廠，酒醅采樣輪次為第四輪次。酒曲的采樣方式：以曲塊對角線的中點作為中心抽樣點，再于對角線上選擇四個與中心樣點距離相等的點作為取樣點，將每次取樣點樣品直接混勻后裝于采樣袋，置于-80 ℃冰箱中備用。酒醅（堆積酒醅、窖內酒醅）采樣方式：每層中心和四角收集，每100 g混合樣品裝于采樣袋，置于-80 ℃冰箱中備用。窖泥采樣方式：從窖池池壁中線位置距池底10 cm處的3個點及池底中心部位分別取10 g窖底泥，混合均勻后裝于采樣袋，置于-80 ℃冰箱中備用。共采集10個樣品，具體樣品采集信息見表1。

表1 樣品采集信息表Table 1 Sample collection information

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMGEA公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司。

1.2 儀器與設備

ABIGeneAmpR9700型聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Illumina Miseq測序平臺：上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；QuantiFlourTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)：美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA提取及MiSeq測序分析

1.3.2 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

測序得到的序列信息，首先根據(jù)雙端序列數(shù)據(jù)之間的對應關系，將成對的數(shù)據(jù)拼接成一條序列，同時對其質量和拼接效果進行質控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的序列和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。之后利用不同軟件進行數(shù)據(jù)分析：通過USEARCH[19]將標簽分組成具有97%相似性的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）?；赟ilva庫對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學注釋分析、利用QIIME[20]等軟件對樣本進行Alpha和Beta多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 醬香型白酒釀造過程中的細菌多樣性分析

2.1.1 Shannon-Wiener曲線分析

Shannon-Wiener[21]是反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣本的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。10個樣品細菌的Shannon-Wiener曲線見圖1。

圖1 10個樣品細菌Shannon-Wiener曲線Fig.1 Shannon-Wiener curve of bacteria in ten samples

由圖1可知，10個樣品細菌的Shannon-Wiener曲線都趨向平坦，說明測序的數(shù)據(jù)量足夠大，對酒醅中微生物多樣性分析基本覆蓋酒醅中細菌的種類。

2.1.2 細菌群落結構分析

基于門（phylum）水平上的樣品群落結構見圖2。

圖2 基于門水平的樣品菌落組成Fig.2 Microbial community composition of samples based on phylum level

結合圖2在門（phylum）水平上分析樣品群落結構組成可知，在門的水平上10個樣品共檢測到16種類群，其中最重要的細菌是厚壁菌門（Firmicutes），在10個樣品間的平均占有百分比達35.1%，平均占有比例最高，其次是變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）等。

基于屬（genus）水平上的樣品群落結構見圖3。

圖3 基于屬水平的樣品菌落組成Fig.3 Microbial community composition of samples based on genus level

由圖3可知，在10個樣品中主要存在34個細菌菌屬，在酒曲中主要是未定義微生物菌群、芽孢桿菌科的未定義菌屬、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）和芽孢桿菌目的其他菌群、堆積發(fā)酵中主要優(yōu)勢菌有未定義微生物菌群、芽孢桿菌科的未定義菌屬、變形菌綱的未定義菌屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和普氏菌屬（Prevotella）；在窖內發(fā)酵中乳桿菌屬（Lactobacillus）占絕對優(yōu)勢；窖泥中主要優(yōu)勢菌有未定義微生物菌群、放線菌（Actinomyces）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋菌屬（Acetobacter）。

2.1.3 多樣本聚類樹

基于樣本OTU即操作分類單元種類數(shù)計算樣本間的weighted unifrac距離矩陣，綜合考量序列數(shù)據(jù)、序列同源性、微生物構成的豐度等對各個樣本進行聚類。聚類樹枝間的距離反應了各樣品間的微生物組成間的親緣關系。樣本相似度分析結果見圖4。由圖4可知，樣品A1和C1歸屬到了一起，說明了不同酒廠A1和C1的細菌組成親緣關系較近，說明不同酒廠間的成品曲細菌群組成相似，這可能是各酒廠之間制曲配方及工藝的相似所致。

圖4 樣本相似度分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of sample similarity

樣品A2和B2歸屬到了一起，但與樣品C2相隔一定距離。說明同一酒廠不論是新車間還是老車間它們堆積發(fā)酵酒醅的細菌組成親緣關系很接近，而不同酒廠堆積發(fā)酵酒醅細菌組成親緣關系較遠。不同酒廠雖然都在茅臺鎮(zhèn)赤水河邊，但酒廠間地理位置有差異，發(fā)酵車間環(huán)境微生物以及來自大曲的微生物親緣關系有較大差異。同時也說明了堆積發(fā)酵與發(fā)酵車間環(huán)境關聯(lián)度較高，發(fā)酵環(huán)境微生物的多樣性影響著堆積酒醅的微生物多樣性。

樣品A3、B3、C3都歸屬到了一起，說明不同酒廠以及同一酒廠新老車間窖內酒醅細菌群組成相似，其中樣品A3和C3親緣關系相對較近。依據(jù)聚類樹枝最先分枝最進化的原理，從圖4亦可知，樣品B3中的微生物進化優(yōu)先于A3和C3中的微生物，說明在窖內釀造環(huán)境中，老窖池的微生物優(yōu)勢菌群最突出。樣品A4和C4沒有歸于同一歸屬并且與酒醅相距較遠，說明不同酒廠窖泥相互之間細菌菌相組成差別較大，這可能是窖泥的來源不同所致。

2.2 釀酒過程優(yōu)勢細菌群落動態(tài)變化分析

2.2.1 酒曲細菌多樣性分析

由圖5可知，H酒廠和J酒廠成品酒曲主要優(yōu)勢菌群組成相似，但細菌主要優(yōu)勢菌群的豐度存在明顯差異。未定義微生物菌群、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）和芽孢桿菌目的其他菌群是H酒廠和J酒廠的成品曲中主要的優(yōu)勢菌群，在樣品A1和C1中占有豐度分別是35.06%和20.86%，19.14%和13.56%，11.13%和15.28%，8.53%和11.12%。說明芽胞桿菌是高溫大曲中的主要微生物菌群。芽孢桿菌具有耐高溫的特性，能夠分泌蛋白酶、淀粉酶等水解原料，產生發(fā)酵性糖和氨基酸，為發(fā)酵釀酒過程中美拉德反應初期階段生成阿馬多利化合物提供大量原料。

圖5 不同車間不同酒廠酒曲樣品細菌群落結構餅狀圖Fig.5 Pie chart of bacterial community structure of different distilleries samples in different workshops

2.2.2 堆積酒醅細菌多樣性分析

堆積發(fā)酵是將淀粉糖化的關鍵環(huán)節(jié)，這時需要更多的微生物代謝產生大量的水解酶類。由于高溫堆積階段要求溫度達50 ℃左右[25]，所以耐熱微生物成為了優(yōu)勢菌群。堆積處于開放式的好氧、兼氧環(huán)境條件下，再次網(wǎng)羅空氣中有益微生物，進一步為產生醬香物質和積累醬香前體物質創(chuàng)造條件，它是生成醬香物質的接力站，直接關系到產品的風格質量。

結合圖6對比分析可得，A2中共發(fā)現(xiàn)450個菌屬，在0.1%以上的菌屬111個，其中樣品A2中的優(yōu)勢微生物菌群為：未定義微生物菌群27.24%、芽孢桿菌科的未定義菌屬5.03%、變形菌綱的未定義菌屬4.74%、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）3.82%、芽孢桿菌目的其他菌群3.01%、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）2.80%、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）2.48%、乳桿菌屬（Lactobacillus）1.61%、魏斯氏菌屬（Weissella）1.18%、普氏菌屬（Prevotella）1.15%、地桿菌屬（Pedobacter）1.05%等。

樣品B2中共發(fā)現(xiàn)404個菌屬，在0.1%以上的菌屬93個，仍以未定義微生物菌群27.24%、乳桿菌屬（Lactobacillus）13.22%、芽孢桿菌科的未定義菌屬5.03%、γ-變形菌綱的未定義菌屬4.74%、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）3.82%、芽孢桿菌目的其他菌群3.01%、普氏菌屬（Prevotella）1.15%為主要優(yōu)勢菌群。樣品A2和B2相比主要優(yōu)勢菌群組成相似，但豐度差異較大，這說明堆積發(fā)酵與發(fā)酵車間環(huán)境有關，同一酒廠，同樣的制酒工藝和酒曲，發(fā)酵車間使用年限長的比新車間微生物多樣性降低，但優(yōu)勢菌群越突出。

J酒廠的堆積酒醅C2中共發(fā)現(xiàn)437個菌屬，在0.1%以上的菌屬有108個。其中未定義微生物菌群27.24%、γ-變形菌綱的未定義菌屬4.74%、芽孢桿菌科的未定義菌屬5.03%、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）3.82%等為主要優(yōu)勢菌屬。樣品A2與C2相比主要優(yōu)勢菌群組成相似，但豐度和占比有較大差異。這說明不同的酒廠發(fā)酵車間之間環(huán)境微生物多樣性的差異影響著堆積酒醅的微生物多樣性。另外，不同酒廠的發(fā)酵工藝雖然相似，但發(fā)酵物料物態(tài)、其工藝參數(shù)及地理位置也會造成優(yōu)勢菌群差異。

2.2.3 窖內酒醅細菌多樣性分析

樣品A3中共發(fā)現(xiàn)400個菌屬，在0.1%以上的菌屬有77個，樣品B3中共發(fā)現(xiàn)292個菌屬，在0.1%以上的菌屬有31個，樣品C3中共發(fā)現(xiàn)404個菌屬，在0.1%以上的菌屬有83個。結合圖7對比分析可知，3種窖內酒醅細菌菌群多樣性均較高，主要優(yōu)勢細菌群組成相似結構相似，但豐度差異較大。乳桿菌屬（Lactobacillus）在窖內發(fā)酵中占絕對優(yōu)勢，在樣品A3、B3和C3中占有豐度分別達到40.37%、74.00%和32.03%。窖內發(fā)酵過程中是處于高溫厭氧環(huán)境，乳酸菌的乳桿菌屬是醬香型白酒窖內發(fā)酵過程中最常見的重要微生物菌群。乳桿菌屬（Lactobacillus）的作用是通過代謝產生乳酸等有機酸。酸類也是主體呈味物質，起緩沖協(xié)調作用，是決定酒的香型、風格的基礎要素之一。與樣品B3相比，樣品A3的細菌多樣性較高，但樣品B3的優(yōu)勢菌群更突出。說明同一酒廠，同樣的制酒工藝和酒曲，不同使用年齡的車間和窖齡的微生物多樣性的差異影響著窖內發(fā)酵酒醅細菌多樣性。老窖池中細菌菌落多樣性同樣較高，并且主要優(yōu)勢細菌的種類和豐度與堆積發(fā)酵酒醅相關度高。這說明使用時間長的車間和窖池其環(huán)境微生物種群結構更穩(wěn)定，優(yōu)勢菌群更突出。樣品C3與A3相比，主要優(yōu)勢菌群相似，但豐度存在明顯差異。說明不同的酒廠發(fā)酵車間使用年限和窖齡影響著窖內酒醅的微生物多樣性。

圖7 不同車間不同酒廠窖內酒醅細菌群落結構餅狀圖Fig.7 Pie chart of bacterial community structure of the fermented grain in pit of different distilleries in different workshops

2.2.4 窖泥細菌多樣性分析

樣品A4中共發(fā)現(xiàn)525個菌屬，在0.1%以上的菌屬有143個，C4樣品中共發(fā)現(xiàn)482個菌屬，在0.1%以上的菌屬有114個。

圖8 不同酒廠窖泥細菌群落結構餅狀圖Fig.8 Pie chart of bacterial community structure in pit mud in different distilleries

由圖8可知，不同酒廠使用的窖泥中細菌組成差異明顯。A4中的主要優(yōu)勢菌群是放線菌（Actinomyces）1.79%、乳桿菌屬（Lactobacillus）1.70%。C4的主要優(yōu)勢菌群是醋桿菌屬（Acetobacter）14.98%、乳桿菌屬（Lactobacillus）2.35%，與樣品A4對比主要優(yōu)勢菌群存在明顯差異。這可能與不同酒廠的窖泥來源和使用時間、使用方法不同有關。

3 結論

本研究應用Illumina MiSeq高通量測序技術，探究醬香型白酒第四輪次酒釀造過程中細菌多樣性，闡明第四輪次酒釀造過程中優(yōu)勢細菌微生物群落結構及其隨釀造工藝動態(tài)變化。結果表明，醬香型白酒的高溫大曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵的細菌資源豐富且主要優(yōu)勢菌群存在動態(tài)變化。在酒曲中主要優(yōu)勢菌有：芽孢桿菌科的未定義菌屬、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）；堆積發(fā)酵中主要優(yōu)勢菌有芽孢桿菌科的未定義菌屬、γ-變形菌綱的未定義菌屬；在窖內發(fā)酵中乳桿菌屬（Lactobacillus）占絕對優(yōu)勢；窖泥中主要優(yōu)勢菌有放線菌（Actinomyces）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌屬（Acetobacter）。同一酒廠新老車間酒曲、堆積發(fā)酵、窖內發(fā)酵、窖泥之間細菌組成相似度較高，不同酒廠酒曲、堆積發(fā)酵、窖內發(fā)酵、窖泥之間細菌組成相似度亦較高，但其優(yōu)勢菌群豐度差異顯著。發(fā)酵車間使用年限及窖齡影響著微生物多樣性；時間長的車間和窖池其環(huán)境微生物種群結構更穩(wěn)定，優(yōu)勢菌群更突出。