董 穎，陳瑩瑩，魏彤竹，陳 愉*

0 引言

軍團菌(Legionella)是引起流行性、散發(fā)性社區(qū)獲得性肺炎和醫(yī)院內(nèi)獲得性肺炎的重要致病菌[1],軍團菌感染后引發(fā)的疾病稱軍團菌病(Legionnaires′ disease,LD)，臨床癥狀可輕可重，其中最多見且最嚴重的臨床類型為軍團菌肺炎，并且常伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、胃腸道和腎臟等肺外并發(fā)癥的存在[2-4]。該病病情進展快，且病死率高[5-6]，其中嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila,LP)的1型為主要致病菌，但其他菌型也可致病[7-8]。軍團菌在自然水環(huán)境中普遍存在，并且經(jīng)常污染人工水系統(tǒng)[9-11]，目前，對環(huán)境分離的軍團菌菌株和臨床分離的軍團菌菌株藥物敏感性的比較鮮有報道。軍團菌治療可選擇的藥物有限，有些病例雖然應用了抗軍團菌的治療，仍然不能逆轉(zhuǎn)其病程。研發(fā)新型抗軍團菌藥物并對其進行深入研究將對提高軍團菌的治愈率起到有益的作用。奈諾沙星是一種新型無氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，其對軍團菌的藥物敏感性尚未見報道。本研究探討了奈諾沙星對嗜肺軍團菌的體外抗菌活性，為臨床治療軍團菌的藥物選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 沈陽2012-2017年環(huán)境水中分離出的嗜肺軍團菌菌株36株，從中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院、中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、沈陽市第四人民醫(yī)院患者痰標本中分離培養(yǎng)的嗜肺軍團菌菌株4株，共40株嗜肺軍團菌菌株。其中經(jīng)鑒定LP 1型 27株，LP 2型4株，LP 3型4株，LP 7型2株，LP 4型、6型、10型各1株。

1.2 儀器與試劑 奈諾沙星(批號：205MP161101，中國藥品生物制品檢定所)；阿奇霉素(批號：130352-201007，中國藥品生物制品檢定所)；左氧氟沙星(批號：130455-201106 中國藥品生物制品檢定所)；軍團菌瓊脂基礎干粉(英國OXOID公司)；BCYE添加劑(英國OXOID公司)；無菌緩沖酵母提取物肉湯(Buffered yeast extract broth,BYEB)；緩沖活性炭酵母浸液瓊脂(Buffered charcoal yeast extract,BCYE)；比濁儀(Micro Scan Turbidity Meter，SIEMENS)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)。

1.3 方法 細胞外藥敏試驗采用的是微量肉湯稀釋法[12]，藥敏試驗參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)制定的標準，將嗜肺軍團菌菌株恢復室溫后，在BCYE培養(yǎng)基培養(yǎng)并傳代2次，制備肉湯后用肉湯增菌2代，調(diào)整菌懸液濃度至濁度為0.5麥氏濃度，之后稀釋至2～8×105CFU/ml備用。實驗藥物溶解后配制成終濃度為512 mg/L，二倍稀釋至0.002 mg/L。用96孔U型板，每孔加入50 μl藥物，再加入50 μl菌懸液，留有空白對照孔。將96孔U型板置37 ℃、2.5%CO2的濕潤恒溫箱中孵育72小時觀察結(jié)果，記錄最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和最低殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration,MBC)。統(tǒng)計MIC50、MIC90、MBC50、MBC90值。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213。

2 結(jié)果

2.1 最低抑菌濃度MIC 3種藥物對40株嗜肺軍團菌的MIC結(jié)果見表1。奈諾沙星的MIC90值最小，其次為左氧氟沙星；阿奇霉素的MIC50和MIC90值均為最大。由結(jié)果可見3種藥物對嗜肺軍團菌均有較好的抗菌活性，喹諾酮類藥物敏感性強于大環(huán)內(nèi)酯類藥物。

2.2 最低殺菌濃度MBC 3種藥物對40株嗜肺軍團菌的MBC結(jié)果見表2。奈諾沙星的MBC90值最小，左氧氟沙星MBC90值稍大，阿奇霉素MBC50和MBC90值均最大。結(jié)果提示，喹諾酮類藥物對軍團菌具有良好的殺菌作用，阿奇霉素殺菌作用較弱，MBC分布范圍較大。

表1 3種藥物對40株嗜肺軍團菌的MIC(mg/L)

表2 3種藥物對40株嗜肺軍團菌的MBC(mg/L)

2.3 按菌株來源分類的MIC值比較 不同來源菌株的MIC值見表3。由結(jié)果可見，對于環(huán)境分離株而言，奈諾沙星抗菌作用最強，而對于臨床株而言，左氧氟沙星抗菌作用最強。奈諾沙星對2種不同來源的菌株MIC值沒有差異，都有較好的抗菌活性，而左氧氟沙星MIC90值在環(huán)境分離菌株組稍高。阿奇霉素對2種不同來源的菌株MIC50和MIC90值均高于其他2種藥物，對環(huán)境分離株的抗菌活性最差。

表3 不同來源菌株的MIC值比較(mg/L)

2.4 按菌株來源分類的MBC值比較 奈諾沙星和左氧氟沙星對于不同來源的菌株均有較好的殺菌作用，兩者均強于阿奇霉素。對于環(huán)境分離菌株而言，奈諾沙星殺菌作用最強；對于臨床株而言，左氧氟沙星殺菌作用最強。左氧氟沙星和阿奇霉素兩種藥物對臨床菌株殺菌效果強于環(huán)境分離菌株。見表4。

表4 不同來源菌株的MBC值比較

2.5 LP1型和非LP1型嗜肺軍團菌的MIC(mg/L)值的比較 LP1型和非LP1型嗜肺軍團菌的MIC值見表5。結(jié)果顯示，奈諾沙星和左氧氟沙星對LP1型和非LP1型軍團菌的藥物敏感性基本一致，而阿奇霉素對兩組的敏感性稍有不同，就MIC50而言，阿奇霉素對LP1型的抗菌活性弱于非LP1型。

表5 LP1型和非LP1型嗜肺軍團菌的MIC值比較

2.6 LP1型和非LP1型嗜肺軍團菌的MBC(mg/L)值比較 LP1型和非LP1型嗜肺軍團菌的MBC值見表6，結(jié)果顯示，奈諾沙星和阿奇霉素對LP1型的殺菌作用弱于非LP1型，以阿奇霉素尤為明顯，而左氧氟沙星的MBC90在LP1型稍低于非LP1型，提示對非LP1型殺菌活性較LP1型稍強，且其MBC范圍的數(shù)值較小。

表6 LP1型和非LP1型嗜肺軍團菌的MBC值比較

3 討論

自1977年美國疾病控制中心(CDC)首次描述軍團病以來[13]，其發(fā)病率逐年增高，引起國內(nèi)外學者們的普遍關注。軍團菌屬于革蘭陰性菌，包括59個種和3個亞種，嗜肺軍團菌是最常見的種[14]。迄今已知約30種軍團菌可引起人類感染，其中已確認嗜肺軍團菌種的16個血清型均可引起感染[15]，多為下呼吸道感染。軍團菌可以在阿米巴原蟲、人巨噬細胞和肺泡上皮細胞內(nèi)寄生及繁殖?？咕幬镄枰┩讣毎みM入細胞內(nèi)才能更有效地殺滅軍團菌。目前，細胞穿透性強的脂溶性藥物(如喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)脂類藥物)是抗軍團菌的主要選擇用藥，然而，有研究發(fā)現(xiàn)軍團菌已出現(xiàn)了對2類藥物耐藥。有學者對149株LP1型嗜肺軍團菌藥敏實驗發(fā)現(xiàn)，紅霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平對軍團菌均敏感，其中25株對阿奇霉素耐藥，并且提示阿奇霉素敏感性的降低與其LpeAB基因的表達有關[16]。在2019年的研究中發(fā)現(xiàn)，122株嗜肺軍團菌菌株中發(fā)現(xiàn)1例臨床LP1型對阿奇霉素(MIC 0.5～1 mg/L)敏感性降低，并含有外排泵成分LpeAB[17]。本研究對40株軍團菌的藥敏實驗發(fā)現(xiàn)，MIC>1 mg/L的菌株有10株，均來自環(huán)境，其中LP 1型7株，LP 2型、LP 3型、LP 4型各1株，同樣提示阿奇霉素的敏感性下降，具體耐藥機制有待于深入研究。

關于軍團菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥，2012年曾有1篇個案報道。1名重癥肺炎患者入院后應用頭孢唑林和慶大霉素抗感染治療，在查出軍團菌尿抗原陽性后改用環(huán)丙沙星400 mg，每天2次，在環(huán)丙沙星抗感染治療4 d后支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)出LP1型軍團菌。藥敏試驗顯示，環(huán)丙沙星對該菌株的MIC值為2 mg/L，超出了抗菌藥物的流行病學界值(ECOFF)1 mg/L[18]。后續(xù)基因檢測顯示，菌株DNA旋轉(zhuǎn)酶的gyrA基因QRDR產(chǎn)生了點突變，導致了83位氨基酸的異位[19]。gyrA是氟喹諾酮類藥物對嗜肺軍團菌的作用靶點，其突變會降低DNA旋轉(zhuǎn)酶對氟喹諾酮類藥物的敏感性[20]，進而產(chǎn)生耐藥。另一項研究同樣發(fā)現(xiàn)在82名軍團菌肺炎患者分離的軍團菌菌株中檢測到2株gyrA83突變[21]，QRDR信號中的gyrA83突變與氟喹諾酮類藥物對嗜肺軍團菌的MIC值增加有關。本研究的40株軍團菌中，奈諾沙星和左氧氟沙星的MIC最大值均為0.5 mg/L，提示尚未出現(xiàn)菌株的耐藥基因突變。

以上研究說明雖然氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物對軍團菌有很高的活性，但已出現(xiàn)了耐氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的軍團菌菌株。因此，在臨床應用氟喹諾酮及大環(huán)內(nèi)酯類藥物進行抗軍團菌治療時，若臨床療效欠佳，應考慮其可能的耐藥性，并且不斷探索新藥對軍團菌的作用，以增加抗軍團菌的藥物選擇。

奈諾沙星是TaiGen生物公司開發(fā)的一種新型的非氟喹諾酮類抗菌藥物，化學式是C20H25N3O4·C4H6O5·1/2 H2O，現(xiàn)應用于臨床的藥物為蘋果酸奈諾沙星。奈諾沙星與其他氟喹諾酮類藥物不同之處在于其C-6位缺少氟原子，這一改變使DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制作用增強了10倍以上，對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等30種細菌的MIC降低至原來的1/100[22]。其生物利用度約為95%，與左氧氟沙星和莫西沙星相似[23-24]。國內(nèi)完成的奈諾沙星的Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗表明，該藥物口服后在健康受試者體內(nèi)吸收迅速，半衰期長，約為11 h。大約70%的給藥藥物是由腎臟排泄的，耐受性良好[25]。第Ⅱ期及第Ⅲ期臨床研究也顯示，口服奈諾沙星(500 mg/d，連用7～10 d)與口服左氧氟沙星(500 mg/d)治療輕至中度CAP的臨床及微生物學療效相同[26-27]。奈諾沙星對革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌都具有較強的廣譜抗菌活性，與同類的氟喹諾酮類抗菌藥物相比，奈諾沙星對于革蘭陽性球菌具有更高的抗菌活性[27]。對于非典型病原體，研究發(fā)現(xiàn)奈諾沙星對147株支原體臨床分離株的活性均與左氧氟沙星、環(huán)丙沙星相似[28]。軍團菌與支原體、衣原體同為非典型病原體，目前臨床研究發(fā)現(xiàn)，奈諾沙星對軍團菌具有很好的臨床療效，但奈諾沙星對軍團菌的藥敏情況及抗菌活性尚未見報道。

本實驗研究了新型無氟喹諾酮類藥物奈諾沙星對嗜肺軍團菌的體外藥物敏感性，并與新大環(huán)內(nèi)酯類藥物阿奇霉素及氟喹諾酮類藥物左氧氟沙星進行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)奈諾沙星對嗜肺軍團菌具有良好的體外抗菌活性，喹諾酮類藥物敏感性強于大環(huán)內(nèi)酯類藥物。在日本學者的1項58株臨床軍團菌菌株的體外藥敏結(jié)果可見，左氧氟沙星的MIC值范圍為0.004～0.03 mg/L，MIC90值為0.015 mg/L，阿奇霉素的MIC值范圍為0.001～0.12 mg/L，MIC90值為0.06 mg/L[29]，提示喹諾酮類藥物對于軍團菌的敏感性強于大環(huán)內(nèi)酯類。此外，意大利學者做了1項100株環(huán)境中軍團菌菌株的藥敏實驗，結(jié)果顯示，左氧氟沙星的MIC90為0.094 mg/L，阿奇霉素的MIC90為0.25 mg/L，由此可見，左氧氟沙星對意大利環(huán)境中提取的軍團菌的抗菌作用優(yōu)于阿奇霉素[30]。廣州的1項60株環(huán)境提取的軍團菌藥敏試驗結(jié)果顯示，左氧氟沙星MIC90為0.031 mg/L，阿奇霉素MIC90為0.5 mg/L，同樣說明左氧氟沙星對環(huán)境軍團菌的效果優(yōu)于阿奇霉素[31]。本實驗結(jié)果顯示奈諾沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素分別為0.031～0.5、0.004～0.5、0.062～4 mg/L，MIC50分別為0.062、0.031、1 mg/L；MIC90分別為0.125、0.5、4 mg/L，MBC分別為0.062～1、0.008～2、0.125～8 mg/L，MBC50分別為0.125、0.125、2 mg/L，MBC90分別為0.5、1、8 mg/L，提示奈諾沙星和左氧氟沙星對軍團菌的敏感性均明顯強于阿奇霉素，在細胞外具有良好的抑菌和殺菌作用，且奈諾沙星的作用優(yōu)于左氧氟沙星。將本實驗研究結(jié)果與其他幾項實驗結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)嗜肺軍團菌的敏感性較其他地區(qū)差，尤其阿奇霉素耐藥性增高，提示可能出現(xiàn)耐藥基因突變，同時提示不同區(qū)域軍團菌菌株存在敏感性的差異，不同區(qū)域菌株敏感性的數(shù)據(jù)對指導當?shù)嘏R床治療更有實際意義，在臨床用藥過程中應予以重視。

對于不同來源的嗜肺軍團菌菌株藥物敏感性的對比研究，在國內(nèi)外尚未查到相關文獻報道，而本實驗結(jié)果顯示，兩組略有差別。本研究通過對比環(huán)境及臨床軍團菌菌株的MIC50、MIC90、MBC50、MBC90值，結(jié)果顯示，奈諾沙星在兩組敏感性方面基本一致，而左氧氟沙星和阿奇霉素對于臨床軍團菌菌株更敏感，而對環(huán)境分離軍團菌菌株的抑菌和殺菌效果較弱，提示環(huán)境中的多種因素均可能誘發(fā)細菌耐藥性增強。奈諾沙星對環(huán)境及臨床菌株均敏感，其原因可能是奈諾沙星為一種新藥，人體內(nèi)尚未產(chǎn)生耐藥，而且對環(huán)境菌株藥物誘導耐藥壓力較小。由于本實驗臨床菌株數(shù)量較少，該結(jié)果也可能與樣本量小有關，需要大樣本實驗加以驗證。

關于LP1和非LP1型嗜肺軍團菌菌株的對比，波蘭的1項28株的環(huán)境軍團菌藥敏提示，阿奇霉素對LP1型軍團菌(n=16)的MIC90值為0.25 mg/L，對非LP1型軍團菌(n=12)的MIC90值為0.47 mg/L[32]，由此看出，阿奇霉素對不同分型的軍團菌的藥物敏感性是不同的，對非LP1型菌株敏感性稍差。日本的軍團菌藥敏實驗中，左氧氟沙星對LP1型軍團菌(n=46)的MIC范圍為0.004～0.03 mg/L，MIC90值為0.015 mg/L，對非LP1型軍團菌(n=12)的MIC范圍為0.000 8～0.015 mg/L，MIC90值為0.015 mg/L，阿奇霉素對LP1型軍團菌的MIC范圍為0.001～0.012 mg/L，MIC90值為0.006 mg/L，對非LP1型軍團菌的MIC范圍為0.015～0.06 mg/L，MIC90值為0.003 mg/L[29]，可看出對比不同分類的軍團菌，藥物的作用效果不同，提示左氧氟沙星對兩組敏感性無差異，而阿奇霉素對LP1型的軍團菌MIC值范圍總體更小，敏感度略高于非LP1型的軍團菌。本研究中，奈諾沙星對于LP1型軍團菌和非LP1型軍團菌的藥物敏感性基本一致，而左氧氟沙星對LP1作用稍強，而阿奇霉素對非LP1型軍團菌抗菌活性稍強，與國外研究結(jié)果有所不同，此差異可能與不同區(qū)域菌株分布不同有關，另需大樣本菌株進行深入研究。

綜上所述，奈諾沙星作為無氟喹諾酮類新藥，對嗜肺軍團菌顯示了良好的體外抗菌活性，明顯優(yōu)于阿奇霉素，略優(yōu)于左氧氟沙星。該研究為奈諾沙星抗軍團菌感染提供了藥物敏感性的理論基礎，對臨床軍團菌治療的藥物選擇具有指導意義。