阮四維，王海鑫，張妙英，蔣文靜，周訓(xùn)竹，曹棟卿，周 燕*

0 引言

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumanii)是臨床尤其在ICU內(nèi)多重耐藥和院感最主要的細(xì)菌之一[1-2]，其泛耐藥及多耐藥特性與其生物膜的形成有關(guān)，生物膜狀態(tài)下細(xì)菌可以抗消毒劑，抗人體的免疫系統(tǒng)，使感染持續(xù)存在且難以治療[1]。既往對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的研究多集中于其攜帶的耐藥基因直接導(dǎo)致的耐藥，本研究分析形成生物膜的相關(guān)特性及多粘菌素B作用于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的最低抑菌濃度、與生物膜形成存在可能關(guān)聯(lián)性的基因[3]、最低生物膜清除濃度以及殺菌機(jī)制，為臨床治療多重耐藥鮑曼感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 選取溫州某三甲醫(yī)院2016年2-10月ICU氣管插管患者分離出的鮑曼不動(dòng)桿菌42株。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床有感染癥狀，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)醫(yī)院獲得性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)判定為醫(yī)院獲得性肺炎。②連續(xù)痰培養(yǎng)2次以上，結(jié)果為鮑曼不動(dòng)桿菌優(yōu)勢(shì)生長。

1.1.2 主要試劑和儀器 細(xì)菌檢定卡購自英國Oxoid公司，藥敏紙片購自法國梅里埃公司，硫酸多粘菌素B購自上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；氨溴索購自常州四藥制藥有限公司。VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定儀由法國梅里埃公司生產(chǎn)，電鏡由日本JOEL株式會(huì)社生產(chǎn)，基因擴(kuò)增儀由杭州博日公司生產(chǎn)，凝膠成像儀為美國BIO-RAD公司生產(chǎn)。質(zhì)控菌株采用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供的大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 鑒定方法和結(jié)果判定均按照操作說明書進(jìn)行；藥敏試驗(yàn)應(yīng)用微量肉湯稀釋法，結(jié)果判斷按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI2019標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.2.2 生物膜形成能力檢測(cè) 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板構(gòu)建生物膜模型，結(jié)晶紫半定量法篩選出成膜能力不同的菌株，并用掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜。

1.2.3 PCR檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜相關(guān)基因 煮沸法提取鮑曼不動(dòng)桿菌DNA，擴(kuò)增abal、bfs、CsuE、ompA及blaPER-1基因，引物序列及擴(kuò)增條件見參考文獻(xiàn)[4]，由上海華大公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA marker對(duì)照確認(rèn)是否含陽性片段，隨機(jī)各挑選2株產(chǎn)物送至上海華大基因公司進(jìn)行純化并測(cè)序。

1.2.4 胞外多糖及蛋白含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[5]，采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍(lán)染液結(jié)合法分別檢測(cè)多粘菌素B用藥前后鮑曼不動(dòng)桿菌的胞外多糖和黏附蛋白含量。

1.2.5 藥物對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的最低抑菌濃度、生物膜清除濃度測(cè)定 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI2019標(biāo)準(zhǔn)方法，相同藥物濃度多粘菌素B作用鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜。選取24 h和48 h生物膜培養(yǎng)物電鏡掃描和激光共聚焦顯微鏡觀察病原菌生物膜。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS 18.0軟件，計(jì)數(shù)、計(jì)量資料比較分別采用χ2檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，有2株(4.8%)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)所有藥物均敏感，35株(83.3%)對(duì)3種以上藥物耐藥，具體見表1。所有鮑曼菌株頭孢他啶的MIC>512 μg/ml，哌拉西林的MIC>512 μg/ml，5株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南的MIC>512 μg/ml，2株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南的MIC為512 μg/ml，美羅培南的MIC>512 μg/ml，頭孢吡肟的MIC>512 μg/ml，阿米卡星和環(huán)丙沙星的MIC>512 μg/ml，左氧氟沙星的MIC≥256 μg/ml，具體藥敏結(jié)果見表1。多粘菌素B的MIC有梯度，7株(16%)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC為0.5 μg/ml，19株(46%)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC為1 μg/ml，6株(15%)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC為2 μg/ml，10株(23%)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC>128 μg/ml，比例見圖1。

表1 鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果[株(%)]

圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌多粘菌素B的MIC(μg/ml)

2.2 鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力分析 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與敏感株24 h、48 h吸光度檢測(cè)顯示其成膜能力有差異，多重耐藥株更容易形成生物膜。見表2。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌和非耐藥菌不同培養(yǎng)時(shí)間OD550值

注：*1t=16.008，P<0.001；*2t=7.214，P<0.001

2.3 PCR檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜相關(guān)基因 42株鮑曼不動(dòng)桿菌檢出abal、bfs、CsuE、ompA及blaPER-1基因均在70%左右，χ2檢驗(yàn)顯示,5種基因在多重耐藥株和敏感株中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見表3。

表3 鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜相關(guān)基因及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[株(%)]

2.4 胞外多糖及蛋白含量 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌胞外多糖和胞外蛋白的測(cè)定結(jié)果見表4。從表4可以發(fā)現(xiàn)，多粘菌素B對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌胞外蛋白和胞外多糖的形成均有明顯作用。

表4 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌胞外多糖(A490)蛋白(A595)測(cè)定結(jié)果(μg/ml)

2.5 掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察和測(cè)定藥物作用前后生物膜 耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌經(jīng)培養(yǎng)后，形成形狀不同的條索狀或斑片狀固著物,成團(tuán)或相互交叉的生物膜。用藥后可見大部分斑片狀固著物相互聚集成團(tuán)固縮，附著面積減小，小部分固著物剝離，無規(guī)律散在。見圖2、圖3。

本實(shí)驗(yàn)采用2種染料對(duì)所研究的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行雙重染色:用FITC標(biāo)記的刀豆蛋白A(FITC-Con A)與生物膜中的多糖結(jié)合發(fā)出綠色熒光,碘化吡啶(PI)與菌體內(nèi)的DNA結(jié)合,可發(fā)出紅色熒光，在蓋玻片上形成生物膜，在用藥前和用藥后取出玻片，采用雙重免疫熒光技術(shù)標(biāo)記多糖和細(xì)菌,并用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察生物膜形成情況。由圖4、圖5可觀測(cè)到耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在用藥前后成膜量的變化，結(jié)果表明，成膜能力隨著用藥劑量的增長而下降。

圖2 耐藥株用藥前掃描電鏡生物膜形態(tài)

圖3 耐藥菌用藥后掃描電鏡生物膜形態(tài)

圖4 耐藥株用藥前共聚焦生物膜形態(tài)

圖5 耐藥菌用藥后共聚焦生物膜形態(tài)

3 討論

生物膜的形成是細(xì)菌耐藥的機(jī)制之一，50%的院內(nèi)感染與醫(yī)療器械裝置上的生物膜相關(guān)聯(lián)[6-7]，生物膜保護(hù)細(xì)菌免受宿主的獲得性免疫應(yīng)答以及吞噬細(xì)胞的捕食，使其耐藥性提高10～1 000倍[8]。本研究菌株來自ICU氣管插管，其體外培養(yǎng)均顯示極易形成生物膜。而多重耐藥菌較敏感菌株更易形成生物膜，顯示其多重耐藥與生物膜形成的協(xié)同效應(yīng)，與其他研究結(jié)果一致[9-10]。研究顯示，形成生物膜的菌株對(duì)不同藥物的耐藥性存在一定差異，對(duì)氨芐西林-舒巴坦、阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶有較高耐藥性，而對(duì)亞胺培南和哌拉西林的耐藥性較低[11-12]，但本次分離菌株對(duì)不同藥物沒有明顯差別，要考慮其他耐藥機(jī)制導(dǎo)致對(duì)藥物的耐藥性。

abal、bfs、CsuE、ompA、blaPER-1為菌毛裝配、形成和黏附生物表面的相關(guān)基因，研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌依靠菌毛黏附物體表面，其黏附力強(qiáng)，不易被外力清除，繼而形成微菌落，隨著菌落擴(kuò)大，生物膜進(jìn)一步成熟[13]，因此，這些基因也被認(rèn)為是生物膜的相關(guān)基因，有一個(gè)或數(shù)個(gè)基因缺失的鮑曼不動(dòng)桿菌則不易形成生物膜[14]。本研究35株多重耐藥菌中，23株(65.71%)均檢測(cè)到了所有的基因，在7株敏感株中均存在一定的基因缺失。因而影響其生物膜形成能力，但結(jié)果也需要排除實(shí)驗(yàn)特異性的影響因素，可能存在一定的不足。

多粘菌素B是從多粘桿菌培養(yǎng)液中分離得到的一種環(huán)肽類抗生素，主要作用于革蘭陰性菌細(xì)胞壁，能與其外膜的脂多糖(LPS)結(jié)合，導(dǎo)致外膜通透性改變，最終通過細(xì)菌的“自發(fā)攝取通路”達(dá)到殺菌的目的[15]。多粘菌素B通過破壞鮑曼不動(dòng)桿菌的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)菌外膜具有快速穿透性的特點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)主要物質(zhì)外漏[16]。同時(shí)，有研究表明，類多粘菌素B與RND外排泵AcrAB-TolC和AdeABC以及非RND外排泵Norm具有最高的結(jié)合親和力[17]，外排泵是一種位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的胞外蛋白質(zhì),能將進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的抗菌藥物泵出，同時(shí)也是構(gòu)成細(xì)菌生物膜的重要組成部分。本研究顯示，用藥后多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌胞外多糖和胞外蛋白含量均明顯減少，電鏡和激光共聚焦顯微鏡下均可觀察到生物膜明顯縮小，因此，可用于臨床鮑曼不動(dòng)桿菌的治療。但多粘菌素B對(duì)腎臟的損害較多見，腎功能不全者應(yīng)減量。

綜上所述，生物膜的形成是鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的重要機(jī)制之一，多粘菌素B對(duì)易形成生物膜的多重耐藥菌有較好的抑制作用，適宜在普通抗菌藥物治療效果不明顯時(shí)選擇使用。