閆曉菲，楊世華，李曉曦，石 剛*，張 睿

0 引言

結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)時(shí)約有30%為晚期，表現(xiàn)為肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移或局部晚期[1]，隨著手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，更有效的化療藥、靶向藥及免疫治療的深入，晚期結(jié)直腸癌生存率有所改善，但治愈手段仍然是手術(shù)，手術(shù)無法根治的患者治療以化療為基礎(chǔ)的靶向治療或免疫治療等綜合方案為主[2]。對靶基因進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)是目前結(jié)直腸晚期腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。結(jié)直腸癌化療中，由于奧沙利鉑(Oxaliplatin，OHP)的引入，晚期結(jié)直腸癌的生存期得到一定程度提高，其靶作用部位為DNA，鉑原子可以與DNA交叉聯(lián)結(jié)，對DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄進(jìn)行拮抗，對氟尿嘧啶的作用進(jìn)行協(xié)同[3]。靶向藥對化療具有協(xié)同增效的作用[4]。前期研究顯示，miR-346在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)高于正常結(jié)腸組織及上皮細(xì)胞，miR-346 mimics促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，miR-346 inhibitor抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，因此，miR-346可能作為影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的靶基因[5-6]。本研究對miR-346在奧沙利鉑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡進(jìn)行檢測，并檢測了凋亡相關(guān)蛋白的變化，目的在于通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察miR-346可能作為奧沙利鉑增效靶基因的可能，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞為SW620人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)方式為L-15細(xì)胞培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。miR-346 mimics及miR-346 inhibitor購自美國INVITROGEN公司，抗體caspase-9及抗體Apaf-1購自美國Sigma公司，抗體Bcl-2及抗體Bax購自上海康城生物公司，奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號：61825-94-3)購自武漢睿辰標(biāo)物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，流式細(xì)胞檢測試劑盒及MTT試劑盒購自美國Santa-Cruz公司。DAPI染色液購自日本TAKARA公司。

1.2 研究方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染 SW620細(xì)胞根據(jù)給予干預(yù)不同分為miR-346 mimic組、miR-346 inhibitor組、MOCK組、OHP組及OHP+miR-346 inhibitor組，選取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先在轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，接種到24孔板，融合度75%以上的SW620細(xì)胞可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-346 mimic或miR-346 inhibitor，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，OHP組及OHP+miR-346給予不同濃度或不同培養(yǎng)時(shí)間的OHP進(jìn)行干預(yù)。Western blot及qRT-PCR檢測MOCK組的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 MTT(Methyl-thiazolyl-tetrazolium)檢測細(xì)胞增殖率或存活率 取對數(shù)生長期的各組SW620細(xì)胞，以密度為4×104/ml細(xì)胞接種到96孔板，按MTT試劑盒操作，實(shí)驗(yàn)需設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，加入15 μl的MTT液(濃度20 μg/L)，以37 ℃溫度孵育4 h后加150 μl DMSO，上酶標(biāo)定量儀，記錄490 nm處光密度值，記錄細(xì)胞增殖率或存活率，3次實(shí)驗(yàn)取平均值分析。

1.2.3 DAPI熒光染色法測定核破碎及固縮相 取對數(shù)期生長未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor的細(xì)胞，以2×105/ml細(xì)胞密度接種于6孔板，給予50 μmol/L濃度的OHP繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液并洗滌后給予4%多聚甲醛進(jìn)行固定，DAPI染色液0.5 ml/孔進(jìn)行染色，給予5 min的避光孵育，以熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)算核破裂及固縮細(xì)胞比率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡 采用流式細(xì)胞儀對不同干預(yù)因素下的SW620細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測，以2×105/ml的細(xì)胞密度將不同干預(yù)因素下的SW620細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，在常規(guī)條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞以PBS液進(jìn)行洗滌，對照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑說明書，流式細(xì)胞儀上樣進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，對凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白 采用裂解液對各干擾因素處理48 h的細(xì)胞進(jìn)行裂解，裂解后進(jìn)行總蛋白抽取，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，電壓在電泳時(shí)設(shè)定為100 V,時(shí)間為100 min，冰浴轉(zhuǎn)移至PVDF膜并漂洗,進(jìn)行60 min封膜，將封閉液吸盡后加入caspase-9(1∶500)、Apaf-1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)及Bax(1∶500)Ⅰ抗,在4 ℃溫度下孵育過夜，TBST進(jìn)行3次洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗,在室溫條件下進(jìn)行孵育1 h，洗滌10 min后進(jìn)行顯色，方法為ECL發(fā)光法，以目的蛋白與GAPDH灰度值比作為灰度值相對表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-346表達(dá)對OHP干預(yù)的SW620細(xì)胞增殖的影響 給予miR-346 mimic及miR-346 inhibitor轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞，MTT法結(jié)果顯示，SW620細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后，miR-346 inhibitor對SW620細(xì)胞增殖具有抑制作用，與MOCK組比較，在96 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.23，P<0.05)。miR-346 mimics對SW620細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，與MOCK組比較，在48 h、72 h及96 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.23，P<0.05；t=2.64，P<0.05；t=3.07，P<0.05)。濃度50 μmol/L的OHP培養(yǎng)SW620細(xì)胞24、48、72、96 h后，OHP對SW620細(xì)胞增殖具有抑制作用，與MOCK組比較，在72 h和96 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.85，P<0.05;t=2.79，P<0.05)。濃度50 μmol/L的OHP+miR-346 inhibitor聯(lián)合培養(yǎng)SW620細(xì)胞24、48、72、96 h后，對SW620細(xì)胞增殖具有抑制作用，與MOCK組及miR-346 inhibitor組比較，在72 h及96 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.85，P<0.05；t=2.79，P<0.05)；與OHP組比較，在72 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.16，P<0.05)。給予0、0.5、5、50、500 μmol/L的OHP，或以上濃度OHP+miR-346 inhibitor培養(yǎng)SW620細(xì)胞72 h，與OHP組比較，OHP+miR-346 inhibitor組SW620細(xì)胞在50 μmol/L及500 μmol/L的OHP濃度下細(xì)胞存活率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.09，P<0.05;t=2.46，P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間對SW620細(xì)胞增殖率的影響

2.2 miR-346表達(dá)對OHP干預(yù)的SW620細(xì)胞凋亡的影響 SW620細(xì)胞給予不同干預(yù)措施培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞術(shù)顯示，給予miR-346 mimics后SW620細(xì)胞凋亡率下降，與MOCK組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.23，P<0.05)；給予miR-346 inhibitor或OHP后，SW620細(xì)胞凋亡率升高，但與MOCK組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.01，P>0.05)。OHP(50 μmol/L)+miR-346 inhibitor共同處理SW620細(xì)胞后，與MOCK組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.25,P<0.01)，分別與miR-346 inhibitor組或OHP組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.17,P<0.05；t=2.45,P<0.05)。見圖3。

圖2 不同OHP濃度對細(xì)胞存活率的影響

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同干預(yù)方式下SW620細(xì)胞凋亡率

2.3 上調(diào)miR-346表達(dá)對OHP誘導(dǎo)SW620細(xì)胞核的作用 DAPI染色法顯示，OHP處理的轉(zhuǎn)染miR-346 inhibitor的SW620細(xì)胞核固縮及破碎顯著增加，與OHP組或MOCK組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.29，P<0.01)。

2.4 miR-346對OHP干預(yù)的SW620細(xì)胞凋亡蛋白的作用 Western blot檢測不同干預(yù)下SW620細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、Apaf-1、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，給予miR-346 mimics后,與MOCK組比較，caspase-9及Bcl-2蛋白水平升高，Apaf-1及Bax蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.68，P<0.05；t=2.85，P<0.05；t=3.16，P<0.05；t=2.28，P<0.05)；給予miR-346 inhibitor后,與MOCK組比較，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.65，P>0.05；t=1.02，P>0.05；t=1.15，P>0.05；t=1.05，P>0.05)；給予OHP后,與MOCK組比較，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.10，P>0.05；t=1.14，P>0.05；t=1.21，P>0.05；t=1.00，P>0.05)；給予OHP+miR-346 inhibitor后,與MOCK組比較，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.43，P<0.05；t=2.54，P<0.05；t=3.06，P<0.05；t=3.17，P<0.05),與miR-346 inhibitor組比較，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，兩組caspase-9及Bcl-2水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.12，P<0.05；t=2.93，P<0.05)；與OHP組比較，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，兩組caspase-9及Bcl-2水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.94，P<0.05；t=3.13，P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測不同干預(yù)條件下凋亡相關(guān)蛋白水平變化

3 討論

結(jié)直腸惡性腫瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)30%為Ⅳ期或局部晚期，能夠達(dá)到根治性切除的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌或局部晚期結(jié)直腸癌仍然有治愈的機(jī)會(huì)，對于不能施行根治性手術(shù)的結(jié)直腸癌，目前通過轉(zhuǎn)化治療，仍有可能達(dá)到R0切除，獲得治愈的機(jī)會(huì)或延長生存期，降低復(fù)發(fā)率[6-7]。對于初始不可切除的結(jié)直腸癌或進(jìn)入晚期一線治療的結(jié)直腸癌，積極的化療或方案中增加靶向治療藥物的綜合治療是目前主流的治療方案[8-10]。奧沙利鉑在結(jié)直腸癌輔助治療、新輔助治療或轉(zhuǎn)化治療中均為一線方案用藥。奧沙利鉑與氟尿嘧啶具有協(xié)同作用，但奧沙利鉑耐藥也是一線治療終止的主要原因。在方案中，綜合靶向藥物能夠?qū)熢鲂?，同時(shí)可能延緩化療藥物的耐藥性[11]。因此，對治療靶點(diǎn)的研究是晚期結(jié)直腸惡性腫瘤綜合治療的研究熱點(diǎn)。越來越多的靶點(diǎn)得到發(fā)現(xiàn)，更多的靶向治療藥物被開發(fā)并應(yīng)用于臨床，一定程度上延長了晚期結(jié)直腸癌患者的生存期。多項(xiàng)研究表明，miRNA與肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌及卵巢癌等多種惡性腫瘤的化療敏感性及耐藥性相關(guān)，對miRNA表達(dá)水平進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)，可能對化療增效或減效，也可能減少化療藥物的耐藥性[12-16]。我們在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[5-6]，對miR-346在奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷作用中的影響進(jìn)行了探討，目的在于發(fā)現(xiàn)新的靶基因，為進(jìn)一步靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

本研究顯示，采用擬似劑或抑制劑對SW620細(xì)胞中miR-346進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)后，細(xì)胞增殖或凋亡隨之上升或下降，表明miR-346對SW620細(xì)胞增殖及凋亡具有調(diào)控作用，下調(diào)其表達(dá)會(huì)誘發(fā)SW620細(xì)胞增殖能力下降，凋亡能力增高。對轉(zhuǎn)染miR-346抑制劑的SW620細(xì)胞進(jìn)一步給予奧沙利鉑處理，與奧沙利鉑單獨(dú)誘導(dǎo)殺傷對比，增殖率進(jìn)一步下降，凋亡率進(jìn)一步增加，表明下調(diào)miR-346表達(dá)會(huì)增加奧沙利鉑對SW620細(xì)胞的殺傷作用，通過觀察細(xì)胞破裂及核固縮的比例證明了這種增效作用。本研究對miR-346表達(dá)上調(diào)或下調(diào)后的凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，下調(diào)miR-346表達(dá)后，凋亡相關(guān)蛋白中凋亡蛋白caspase-9及Bcl-2下降，Apaf-1及Bax升高,miR-346抑制劑與奧沙利鉑協(xié)同處理細(xì)胞后，這種蛋白改變較單獨(dú)應(yīng)用奧沙利鉑更為明顯。Caspase-9是半胱氨酸蛋白酶，作為細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵酶，受到上游基因激活后能夠引起caspase的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞凋亡[17]。Apaf-1能夠激活caspase通路，召集caspase-9,形成凋亡體，促進(jìn)凋亡[18]。Bcl-2能夠誘發(fā)線粒體中凋亡因子釋放，激活caspase，從而誘發(fā)凋亡[19]。本研究表明，miR-346能夠影響奧沙利鉑對凋亡相關(guān)蛋白的作用，但作用的信號通路及準(zhǔn)確靶點(diǎn)有待研究。另有研究顯示，miR-346在其他惡性腫瘤中可能作用于其他的信號通路。Guo等[20]研究表明，在肝癌中，miR-346可對乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1產(chǎn)生下調(diào)作用，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展。Miao等[21]研究表明，miR-346可以對KLF4發(fā)揮靶向調(diào)節(jié)作用，從而介導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化及增殖。Zhu等[22]研究顯示，miR-346在肝細(xì)胞癌中靶向作用于SMYD3依賴性通路，從而對肝癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用[22]。這些研究均表明，miR-346在惡性腫瘤中的作用及其對化療藥物增敏的作用可能是多基因多通路參與的，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

本研究觀察了miR-346水平變化對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株增殖及凋亡的影響，及其對奧沙利鉑介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷作用的增效作用，結(jié)果表明，miR-346表達(dá)通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白增強(qiáng)奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用，但miR-346是否可以作為靶向治療的靶點(diǎn)，其作用的具體靶基因及上游調(diào)控其表達(dá)的靶基因及通路等研究需要進(jìn)一步開展。