劉婉晴，劉 航,楊婧藝，馬 英

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常見的一種癡呆類型，約占癡呆病例的70%[1]。AD典型臨床癥狀是認知功能障礙中所包含的記憶能力進行性下降，神經(jīng)病理學(xué)標志是在腦組織神經(jīng)元細胞外出現(xiàn)β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的神經(jīng)炎性淀粉斑塊、tau蛋白異常磷酸化所形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，而Aβ沉積可引起腦實質(zhì)的損傷，可能與學(xué)習(xí)、記憶和認知功能障礙過程中神經(jīng)元丟失有關(guān)[2]。神經(jīng)再生是神經(jīng)干細胞產(chǎn)生神經(jīng)元的過程,包括4個階段：神經(jīng)干細胞的增殖、分化、存活以及成熟[3]。有研究發(fā)現(xiàn),Aβ沉積的AD轉(zhuǎn)基因小鼠其海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失可以引起學(xué)習(xí)和記憶能力的損害[4]。腦成像顯示,在AD的發(fā)展過程中，海馬最易受到影響，萎縮程度最為明顯[5]。因此，AD發(fā)生的根本原因在于海馬受到了損害。海馬位于大腦顳葉中的雙側(cè)結(jié)構(gòu)，不同區(qū)域的功能也不同，其中CA3和CA1區(qū)域在學(xué)習(xí)和記憶中擔(dān)任重要作用[6]。有報道，AD海馬CA3和CA1區(qū)域神經(jīng)元丟失導(dǎo)致錐體層萎縮[7]，也有研究發(fā)現(xiàn)，在AD大鼠海馬CA1和CA3區(qū)域顯示出神經(jīng)元數(shù)目增加[8]。本研究主要目的是檢測AD小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊沉積增多對CA3和CA1區(qū)域神經(jīng)元以及細胞增殖的影響，并探討其損傷學(xué)習(xí)及記憶能力的機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組 將雄性12月齡小鼠(均在中國醫(yī)科大學(xué)動物部購買)分為2組：APP/PS1小鼠5只作為實驗組(AD組)，是表達嵌合小鼠/人淀粉樣前體蛋白(Mo/HuApp695swe)和突變型人早老蛋白(PS1)的Tg小鼠，Mo/HuApp695swe可使小鼠產(chǎn)生人類的Aβ沉積；C57BL/6J 野生型小鼠5只作為對照組(C57組)。在實驗前至少10 d將小鼠轉(zhuǎn)移到動物實驗室以適應(yīng)環(huán)境，在標準條件[12 h光照/黑暗循環(huán)，溫度(21±2)℃]下飼養(yǎng)動物，使其自由獲取食物和水。

1.2 水迷宮實驗 檢測小鼠行為學(xué)變化，采用Morris水迷宮恒溫游泳池(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)測試小鼠空間記憶能力，試驗在裝有23～26 ℃溫水的圓形水池中進行，水池直徑為160 cm，深70 cm，水深40 cm，分為4個象限，一個9 cm×9 cm圓形平臺置于第4象限水平面下1 cm，攝像機位于水平面上方170 cm處，實驗一共為6 d，前5.5 d為學(xué)習(xí)訓(xùn)練，最后1 d下午開始進行測試。迷宮分析軟件記錄小鼠游泳總路程、第4象限活動時間、站臺穿越次數(shù)和周邊活動時間等數(shù)據(jù),以分析小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。水迷宮實驗結(jié)束后多聚甲醛灌注，收集12月齡小鼠腦組織，隨后石蠟包埋。

1.3 取材 在小鼠進行水迷宮檢測后，麻醉，200 ml 4%多聚甲醛灌注后獲得大腦，放置在70%乙醇內(nèi)，隨后用二甲苯處理，石蠟包埋，隨后用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.4 免疫組化檢測海馬及皮質(zhì)Aβ斑塊沉積 將兩組小鼠石蠟包埋的腦組織置于切片機上，獲得厚度為5 mm的連續(xù)冠狀切片，間隔為200 mm,將切下的組織置于載玻片上；進行常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，然后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；為阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，將載玻片置于3%雙氧水中，并在室溫下孵育20 min，PBS沖洗；滴加山羊血清(1∶10，Solarbio，#SL038),37 ℃孵育30 min；然后在切片上滴加兔抗β淀粉樣蛋白抗體(1∶400，Cell Signaling Technology，#9888S)放入4 ℃孵育過夜；室溫復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次；加入二抗工作液：辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶200，Solarbio，#SE134)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次；用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水封片。通過連接至光學(xué)顯微鏡的相機捕獲圖像，使用Image J軟件計數(shù)每只小鼠切片中×20顯微鏡獲取的海馬和皮質(zhì)中Aβ斑塊沉積的百分比。

1.5 免疫組化檢測CA3以及CA1區(qū)域NeuN、ki-67表達 將石蠟包埋的兩組小鼠腦組織置于切片機上，得厚度為5 mm的連續(xù)冠狀切片，置于載玻片上。常規(guī)脫蠟后進行抗原修復(fù)，室溫下用3%雙氧水處理切片以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后孵育一抗：鼠抗NeuN(1∶100，Millipore，America，#MAB377)，鼠抗ki-67(1∶200，abbkine，America，#ABM40064)；4 ℃孵育過夜，PBS常規(guī)沖洗繼而加入二抗：辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(1∶200，Solarbio，China，#SE131),DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水封片。通過顯微鏡相機捕獲圖像，使用Image J軟件計數(shù)每只小鼠切片中×40顯微鏡獲取的海馬CA3、CA1區(qū)域的NeuN陽性細胞百分比以及ki-67陽性細胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力比較 兩組小鼠總路程(圖1A,F=0.788，P<0.05)、第4象限活動時間(圖1B,F=2.333，P<0.05)、站臺穿越次數(shù)(圖1C,F=0.025，P<0.05)、周圍活動時間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1D,F=1.507，P=0.05)；與C57組小鼠相比，AD組小鼠的行為學(xué)測試顯示，學(xué)習(xí)和記憶能力明顯損害。

圖1 兩組小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力比較

2.2 兩組小鼠海馬及皮質(zhì)Aβ斑塊密集沉積比較 AD組小鼠Aβ斑塊主要分布在海馬以及皮質(zhì)區(qū)域，呈深棕色，與C57組比較分布更為密集。計數(shù)兩組小鼠海馬與皮質(zhì)Aβ斑塊沉積數(shù)量，結(jié)果顯示，在海馬區(qū)，AD組斑塊沉積數(shù)百分比為(5.019%±1.457%)，而C57組為(0.176%±0.079%)；在皮質(zhì)區(qū)，AD組斑塊沉積數(shù)百分比為(7.429%±2.002%)，而C57組為(0.571%±0.159%)。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.073,P<0.05；F=7.761，P<0.05)。見圖2。

2.3 兩組小鼠CA3和CA1區(qū)NeuN陽性細胞及ki-67陽性細胞表達比較 NeuN是成熟神經(jīng)元特異性標記物，檢測NeuN陽性細胞數(shù)可以評估CA3、CA1區(qū)神經(jīng)元密度。圖3顯示，與C57組小鼠相比，AD組小鼠CA3和CA1區(qū)NeuN陽性細胞數(shù)量減少，AD小鼠CA3和CA1區(qū)域NeuN陽性細胞百分比分別為(4.769%±1.038%)、(5.029%±1.176%)，C57小鼠CA3和CA1區(qū)域NeuN陽性細胞百分比為(16.161%±1.516%)、(13.121%±2.356%)(F=2.209,P<0.05；F=4.160，P<0.05)，提示AD組小鼠CA3、CA1區(qū)神經(jīng)元丟失較C57組嚴重。

Ki-67是細胞增殖標記物，檢測ki-67陽性細胞數(shù)評估CA3、CA1區(qū)細胞增殖能力。圖4顯示，與C57組小鼠相比，AD組小鼠CA3和CA1區(qū)ki-67陽性細胞數(shù)量下降，AD小鼠CA3和CA1區(qū)域ki-67陽性細胞百分比分別為(4.872±1.029)%、(4.150±1.239)%，C57小鼠CA3和CA1區(qū)域ki-67陽性細胞百分比為(10.551±2.004)%、(8.354±1.458)%(F=3.656，P<0.05；F=0.005，P<0.05),提示AD組小鼠較C57組小鼠CA3、CA1區(qū)細胞增殖能力下降。

圖2 兩組小鼠海馬及皮質(zhì)Aβ斑塊密集分布比較

圖3 兩組小鼠CA3和CA1區(qū)NeuN陽性細胞表達比較

圖4 兩組小鼠CA3和CA1區(qū)ki-67陽性細胞表達比較

3 討論

大腦中的Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β-淀粉酶和γ-分泌酶的連續(xù)切割產(chǎn)生。β-分泌酶切割生成APP片段和C99肽，C99肽繼而再由γ-分泌酶切割產(chǎn)生Aβ[9]。Aβ1-42和Aβ1-40是Aβ中最常見的亞型，在腦脊液和血漿中，Aβ1-40是Aβ1-42的10倍和1.5倍。Aβ1-42是AD病理學(xué)中的關(guān)鍵因素，能夠形成Aβ斑塊沉積的核心。此外，Aβ1-42具有神經(jīng)毒性，因此，大腦中的Aβ沉積是AD發(fā)病機制的早期毒性事件[10-11]。本研究的Aβ斑塊沉積及行為學(xué)檢測提示，12月齡AD轉(zhuǎn)基因小鼠較同月齡C57正常小鼠，Aβ斑塊沉積在海馬及皮質(zhì)區(qū)域密集分布，并且小鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力明顯受損。這與Wirths[12]的實驗結(jié)果相似，12～14月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)病理學(xué)顯示，海馬中存在大量的淀粉樣沉積物，小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力受損。Unger等[2]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，Aβ斑塊沉積在4月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中就可以檢測到,隨著月齡的增長，海馬以及皮質(zhì)中斑塊負荷顯著增加。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，Aβ質(zhì)粒免疫治療可以促進Aβ清除，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而緩解小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶損害[13]，以上研究提示，Aβ斑塊沉積的增多可以引起AD小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶損害。

Aβ沉積可以引起腦實質(zhì)的損傷，影響最為顯著的是海馬等與智能有關(guān)的區(qū)域，從而引起學(xué)習(xí)和記憶障礙[14]。海馬DG、CA3和CA1緊密聚集的神經(jīng)元構(gòu)成單向神經(jīng)回路，研究報道，神經(jīng)退行性疾病過程中CA3、CA1區(qū)域與學(xué)習(xí)記憶功能息息相關(guān)[15]。在海馬注射Aβ1-42可引起CA3區(qū)廣泛的神經(jīng)元變性，表現(xiàn)為CA3中神經(jīng)元丟失及核收縮，神經(jīng)元丟失導(dǎo)致AD小鼠腦中學(xué)習(xí)和記憶能力受損，因此，控制神經(jīng)元丟失可能是延遲甚至逆轉(zhuǎn)AD發(fā)展的潛在療法[16]。Padurariu等[17]的研究證實，與年齡相匹配的對照組相比，AD患者海馬區(qū)神經(jīng)元密度顯著降低，尤其是在CA3和CA1區(qū)域。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，早期即出現(xiàn)神經(jīng)元選擇性丟失，而Aβ是引起神經(jīng)元丟失的主要因素[18]。本研究表明，AD小鼠Aβ的沉積增多促進小鼠CA3和CA1神經(jīng)元丟失，進而導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力受損。導(dǎo)致神經(jīng)元丟失的原因存在爭議，體外實驗證明，Aβ促進細胞外Ca2+內(nèi)流，增加細胞對氧化應(yīng)激和興奮性毒性的易感性，從而加劇細胞死亡[19]。Aβ斑塊具有毒性，可減少乙酰膽堿(Ach)的合成，合成受阻后導(dǎo)致神經(jīng)元功能減退或者死亡[20]，也有研究報道，在AD小鼠腦內(nèi)，Aβ的沉積使星型膠質(zhì)細胞被激活，產(chǎn)生神經(jīng)炎癥，使神經(jīng)元數(shù)目顯著丟失。

在成年期，神經(jīng)再生主要發(fā)生在以下2個區(qū)域：海馬齒狀回的顆粒下層和側(cè)腦室的室管膜下區(qū)，但是也不排除其他區(qū)域依舊存在神經(jīng)再生情況[21]。增殖的神經(jīng)干細胞(NSCs)(表達ki-67)分化為中間前體細胞D，D細胞遷移為成神經(jīng)細胞，經(jīng)歷4～8周，其生理學(xué)和解剖學(xué)接近完全成熟的神經(jīng)元(表達NeuN)，接收來自內(nèi)嗅皮層的信息并投射到CA3區(qū)域，進一步傳遞到CA1區(qū)域，神經(jīng)再生過程增加了海馬回路的可塑性以及復(fù)雜性[22-23]。Zeng等[24]在APP/PS1/Nestin-GFP三重轉(zhuǎn)基因小鼠與正常小鼠比較的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)干細胞數(shù)目減少，未成熟神經(jīng)元的存活率下降。并且還有研究提示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)再生下調(diào)，其神經(jīng)干細胞增殖下降，神經(jīng)元減少導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙[25]。但是Jin等[26]發(fā)現(xiàn)，AD患者的海馬組織與非AD患者的海馬組織比較，AD患者海馬區(qū)成熟神經(jīng)元的存活數(shù)目有所增加，海馬區(qū)神經(jīng)再生上調(diào)，上調(diào)原因可能是因為機體的一種內(nèi)源性代償機制，在病理條件下開啟對認知障礙的保護[27]，但是隨著時間的推移，這種代償機制是否可以一直持續(xù),尚不明確，有待于進一步研究不同時期的變化。有研究顯示，AD患者海馬的CA1區(qū)域ki-67陽性細胞數(shù)目增加[28]，而本研究中ki-67數(shù)目減少，原因可能是檢測ki-67的時間階段不一致。當(dāng)神經(jīng)炎癥加劇時，增殖細胞數(shù)目可能增加，并且其大部分增殖的細胞可能分化為膠質(zhì)細胞，隨后神經(jīng)干細胞增殖能力遠遠低于正常小鼠，ki-67將會迅速下降。本實驗研究檢測CA3、CA1區(qū)域ki-67陽性細胞的表達，與C57組正常小鼠相比，AD小鼠ki-67陽性細胞數(shù)目下降，提示AD小鼠神經(jīng)干細胞增殖能力下降，這也可能是相同區(qū)域NeuN陽性細胞代表的神經(jīng)元數(shù)目減少的重要原因。神經(jīng)元丟失是導(dǎo)致AD小鼠腦中學(xué)習(xí)和記憶受損的不可逆的過程，因此，操控神經(jīng)再生以補償神經(jīng)元丟失可能是延遲甚至逆轉(zhuǎn)AD進展的潛在療法。

綜上所述，與同月齡的C57正常小鼠相比，12月齡AD小鼠腦內(nèi)有大量的Aβ斑塊沉積，并且海馬亞區(qū)CA3、CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元丟失明顯及細胞增殖能力下降，提示下調(diào)此區(qū)域的神經(jīng)再生，可導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯損害。但是針對Aβ斑塊沉積引發(fā)的神經(jīng)元丟失及神經(jīng)再生下降的機制尚不明確，是以后研究的方向，調(diào)節(jié)神經(jīng)再生將成為緩解甚至逆轉(zhuǎn)AD的嶄新治療靶點。