高俊杰，陳 達(dá)

(沈陽理工大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,沈陽 110159)

測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多，從原始的一百多年前的濁度法、凱氏定氮法中走出來，改變原體系的光譜性能，從而達(dá)到定量測定的目的。目前研究較多、應(yīng)用較廣、操作較為簡便的是吸光光度法[1-3]、熒光光度法[4]，以及新發(fā)展起來的共振瑞利散射法[5]、高效液相色譜法[6]等等。這些方法都需要專業(yè)人員用專業(yè)儀器進(jìn)行測定。

試紙法[7]是紙層析法中的一種，紙層析法用濾紙作為載體，用一定溶劑(展開劑)展開而達(dá)到分離的目的。根據(jù)其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等。

試紙法具有攜帶方便、使用方便、快速，適用于現(xiàn)場檢測，沒接受過專業(yè)培訓(xùn)的人員也可以使用，拓寬了應(yīng)用范圍。

現(xiàn)在常用的試紙法是在濾紙上以一定的方法負(fù)載上相應(yīng)的試劑，使其對某種物質(zhì)具有反應(yīng)性能，能指示出該物質(zhì)的存在和含量。目前市售的測定試紙都是通過顏色變化，利用色標(biāo)指示試樣含量的。

本文測定蛋白質(zhì)試紙是利用剛果紅與蛋白質(zhì)在一定條件下生成紅色復(fù)合物為基礎(chǔ)，制作試紙，根據(jù)試紙變色的長度，由工作曲線或長度標(biāo)尺確定蛋白質(zhì)含量。這種方法使測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度比觀看顏色更精確。此法目前報道的不多，是一種行之有效有發(fā)展前景的測定方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

0.1mol/L鹽酸；0.1mol/L檸檬酸鈉；5.0×10-5mol/L剛果紅；0.1%(十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)；5mg/mL淀粉溶液；5mg/mL抗壞血酸溶液；1g/L牛血清蛋白；紫外可見分光光度計(jì)，分析天平；酸度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試紙制作方法

取中性層析濾紙，剪裁成10mm寬一定長度的試紙條，并在試紙下端5mm做一下標(biāo)記。

在10mL比色管中加入4mL剛果紅，然后加入一定酸度的緩沖溶液，加入0.1mL CTMAB再加入2mL淀粉溶液，0.8mL抗壞血酸溶液，定容搖勻，再將試紙條完全浸入其中，浸泡15min左右取出晾干。

1.2.2 測定方法

取10mL的待測溶液到小燒杯中,3個制作好的試紙條浸入溶液5mm，反應(yīng)15min后，立即從標(biāo)記處測量試紙上色帶的高度(長度)，取平均值，在試紙標(biāo)尺或工作曲線上查出蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 緩沖體系及酸度的確定

酸度值是影響蛋白質(zhì)與顯色劑結(jié)合反應(yīng)的重要因素。在檸檬酸鈉-鹽酸緩沖體系中，剛果紅與BSA的結(jié)合反應(yīng)在室溫下能很快進(jìn)行，且反應(yīng)快速，顏色對比性好，靈敏度高。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，在pH值為2.0～3.0時，選取不同酸度，得出pH為2.62時反應(yīng)效果最好，試紙顏色變化最為明顯。

表1 緩沖溶液pH的確定

2.1.2 溶液中各組分含量的確定

緩沖溶液含量在1～2mL時隨著緩沖溶液用量的增加，試紙顏色變化越明顯，表2為緩沖溶液用量，從表2中可以看出，緩沖溶液的用量為1.2mL和1.4mL時試紙變色長度最長，為節(jié)約試劑用量，取緩沖溶液的用量為1.2mL。

表2 緩沖溶液用量的確定

2.1.3 反應(yīng)溫度的選擇

在20～25℃的室溫條件下，試紙染成藍(lán)色的過程較慢，耗費(fèi)時間長；試紙晾干過程受溫度影響很大，溫度稍高或受到光照試紙即會變色，穩(wěn)定性差；所以需要在陰涼干燥處晾干試紙。

2.1.4 表面活性劑的選擇

表3為表面活性劑用量。由于表面活性劑有增溶、增穩(wěn)、增敏、增效、催化、分散、富集、乳化、提高抗干擾性和提高選擇性等作用，為了縮短制作試紙的時間，改善試紙的分析性能，通過比較CTMAB和吐溫-80，在表3中可知CTMAB為0.1mL和0.15mL時實(shí)驗(yàn)結(jié)果最好，為節(jié)約成本，選定CTMAB的最佳用量為0.1mL。

表3 表面活性劑用量

2.1.5 淀粉用量的選擇

淀粉作為穩(wěn)定劑使用，取0.5g淀粉將其溶解在100mL熱水中作為原溶液，取1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL淀粉原溶液，向其中加入4.0mLGCR，1.2mL緩沖溶液，0.1mLCTMAB。結(jié)果表明，隨淀粉加入量的增多，濾紙變藍(lán)效果越明顯，吸附效果越好，染色速度加快。用2.0mL淀粉制備的溶液浸泡后的試紙晾干后，浸入蛋白質(zhì)溶液中，試紙變紅速度明顯加快，反應(yīng)時間縮短。

2.1.6 抗壞血酸的確定

抗壞血酸最為抗氧化劑，加入含量的多少影響著試紙?jiān)谥苽浜箢伾兓某潭群头磻?yīng)效果，取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL抗壞血酸，向其中加入4.0mLGCR、1.2mL緩沖溶液、0.1mLCTMAB。結(jié)果表明，加入抗壞血酸量過少，制得的試紙?jiān)诹栏蛇^程仍容易被氧化而變成紅色；但加入抗壞血酸的量過多，雖然能使試紙?jiān)诹栏蛇^程中保持藍(lán)色不變，但將試紙浸入蛋白質(zhì)溶液中后，反應(yīng)速度很慢，試紙變紅所需時間太長且試紙變紅的長度太短，效果不好；而加入0.8mL抗壞血酸制得的試紙不僅在晾干過程中保持藍(lán)色，且其與蛋白質(zhì)反應(yīng)速度較快，效果很好。

2.2 工作曲線和試紙標(biāo)尺的制作

按試驗(yàn)方法測定不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

由圖1可以看出，在40～120mg/L之間，試紙的變色長度與蛋白質(zhì)濃度之間存在線性關(guān)系，其線性方程為y=0.2975x+3.3(40mg/L≤y≤120mg/L)。相關(guān)系數(shù)r=0.9172

應(yīng)用本方法也可較直觀地制作一個刻度標(biāo)尺，測定變色長度，通過直接比較得到結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品測定結(jié)果值，得試紙標(biāo)尺如圖2所示。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 試紙標(biāo)尺

2.3 樣品的測定

用制得的試紙測樣品：奶粉(濃度100mg/L)、尿液和污泥，樣品分別取10mL，每種樣品分別測量5次。

2.4 污泥的預(yù)處理

取60.0mL的污泥，以5000r/min離心10min,取上清液加入0.9%NaCl使之達(dá)到60.0mL，在5000r/min的條件下離心10min,重復(fù)清洗3次，保留第三次污泥溶液。加數(shù)滴1mol/L的NaOH溶液，使pH為11，在80r/min的磁力攪拌器下攪拌10min，在80℃下水浴30min，冷卻至室溫，再在5000r/min下離心20min，用0.45μm濾膜過濾待用。測奶粉時，試紙平均變色長度為34.1mm；測尿樣時，試紙平均變色長度為21.3mm。配制濃度為100mg/L的奶粉，取10mL與100mL放入小燒杯，用所制的蛋白質(zhì)試紙平行測定5次，記錄下紙帶變色的長度，計(jì)算出測定值和精密度；然后分別取5mL的奶粉、尿液和活性污泥分別放入100mL的小燒杯中，再加入濃度為40mg/L的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，用所制的蛋白質(zhì)試紙平行測定5次，記錄下紙帶變色的長度，以此確定加標(biāo)回收率。結(jié)果如表4所示。由表4可知，試紙法對奶粉的測定效果最好。

表4 試紙法測定結(jié)果

2.5 對照實(shí)驗(yàn)

考馬斯亮藍(lán)(CBB)[8]法是一種經(jīng)典的測量蛋白質(zhì)的方法，本文對樣品用CBB進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品測定結(jié)果見表5。

表5 考馬斯亮藍(lán)法測定結(jié)果

由表5和表4對比可以看出，試紙法與考馬斯亮藍(lán)法測定結(jié)果相符，表明試紙法的測定結(jié)果可信。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)的試紙法是通過標(biāo)尺上顏色的變化長度來進(jìn)行定量分析測定蛋白質(zhì)的，比常見的試紙法更容易操作，測定結(jié)果更準(zhǔn)確、精密，方法操作簡單、快速，可以對40～120mg/L蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定，與測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法(考馬斯亮藍(lán)法)相比較無顯著差異。此方法適用于含蛋白質(zhì)的奶粉、尿液、污泥等樣品中蛋白質(zhì)的測定。