王旭生，朱欣茹，張朝輝，宋景貴

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中后常見(jiàn)的神經(jīng)精神障礙性并發(fā)癥，發(fā)病率達(dá)20%～79%，嚴(yán)重影響患者日常生活能力及神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，使致殘率、死亡率升高[1]。目前，PSD的病理生理機(jī)制尚未明確，國(guó)內(nèi)外較認(rèn)可的有兩大學(xué)說(shuō)：生物學(xué)機(jī)制和社會(huì)心理學(xué)機(jī)制[2-3]，其中生物學(xué)機(jī)制主要包含有炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)、發(fā)病部位等因素。目前已有研究證實(shí)炎癥因子與卒中相關(guān)[4]，但炎癥因子是否在PSD發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮作用，相關(guān)研究仍較少。本文以PSD大鼠為研究對(duì)象，探討炎癥因子IL-17A、IL-1β、TNF-α與PSD的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備 選取無(wú)特定病原體級(jí)SD雄性大鼠30只，周齡6～8周，許可證號(hào)：SCX（京）2016-0011。按照隨機(jī)數(shù)字表法將30只SD雄性大鼠分為3組：假手術(shù)組、卒中組、PSD組，每組各10只，均行蔗糖偏好指數(shù)、曠場(chǎng)直線距離測(cè)試，作為行為學(xué)基線評(píng)估，三組間大鼠無(wú)差異。

卒中模型制備：卒中組和PSD組大鼠進(jìn)行左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血90 min再灌注，并于術(shù)后24 h進(jìn)行Longa 5分神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)估，選取分值為1～3分的大鼠，作為卒中模型大鼠。

假手術(shù)組模型制備：僅用左側(cè)切開(kāi)手術(shù)口，不進(jìn)行線栓栓塞。

PSD組模型制備：卒中模型造模后孤籠飼養(yǎng)，1周后予慢性輕度刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS），如晝夜顛倒、禁食、禁水、行為限制、夾尾、噪音刺激、潮濕墊料、足底電擊等方式，每天給予1～2種刺激，連續(xù)4周。抑郁造模成功標(biāo)準(zhǔn)：精神萎靡不振、毛色晦暗、活動(dòng)度較少、易激惹，蔗糖偏好指數(shù)、曠場(chǎng)直線距離明顯降低。

1．2 標(biāo)本處理和指標(biāo)測(cè)定 CUMS刺激4周結(jié)束后，對(duì)三組大鼠進(jìn)行蔗糖偏好指數(shù)、曠場(chǎng)直線距離測(cè)試，評(píng)估大鼠快感缺失、運(yùn)動(dòng)探索能力等抑郁行為，剔除抑郁造模失敗的大鼠。評(píng)估結(jié)束后將大鼠分別進(jìn)行新鮮取腦和多聚甲醛灌注，留取外周血，并對(duì)新鮮腦進(jìn)行分區(qū)保存。

1．2．1 ELISA法檢測(cè)外周血IL-17A含量 對(duì)外周血進(jìn)行冰凍離心機(jī)離心（3500 r/min，4℃，15 min），將其上清液吸至于一新的EP管中。使用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中IL-17A含量。

由圖3可知，900 ℃煅燒生成的生石灰作為鈣質(zhì)原料時(shí)，制備得到硬硅鈣石纖維體積密度為90.8 kg/m3； 隨著煅燒溫度的升高，生成的石灰活性增加，合成了直徑更小的硬硅鈣石纖維，其體積密度僅為70.4 kg/m3；當(dāng)溫度升至1 100 ℃后，煅燒生成的生石灰活性開(kāi)始下降，合成的硬硅鈣石纖維體積密度逐漸增大，1 200 ℃煅燒生石灰合成的硬硅鈣石纖維體積密度增至80.2 kg/m3。由此可見(jiàn)，石灰活性越高，合成的硬硅鈣石纖維體積密度越小。

1．2．2 尼氏染色觀察左側(cè)海馬神經(jīng)元情況 每組各取3只大鼠進(jìn)行多聚甲醛外固定，石蠟脫水后進(jìn)行石蠟切片，并使用尼氏染色液（碧云天）對(duì)各組大鼠腦組織切片進(jìn)行染色，觀察各組左側(cè)海馬神經(jīng)元情況。

1．2．3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)海馬IL-1β、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)水平 取各組剩余大鼠左側(cè)海馬并加入1 mL Trizol試劑進(jìn)行研磨和裂解，提取海馬RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，含cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，SYBR Green 10 μL，無(wú)酶水6 μL。PCR反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，GAPDH作為內(nèi)參（表1）。軟件分析Ct值及相對(duì)值（relative quantity，RQ），RQ=2-ΔΔCt，計(jì)算炎癥因子IL-1β、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用進(jìn)行表示，多組間差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間差異應(yīng)用t檢驗(yàn)，以P＜0．05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

表2 各組大鼠IL-1β和TNF-α mRNA基因相對(duì)表達(dá)結(jié)果

圖1 光鏡下（400×）各組大鼠左側(cè)海馬神經(jīng)元圖片

2 結(jié)果

造模期間假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡，卒中組死亡1只，PSD組死亡2只，最終假手術(shù)組大鼠10只，卒中組9只，PSD組8只。

2．1 外周血IL-17A水平 假手術(shù)組、卒中組和PSD組大鼠血清IL-17A水平分別為18．56±2．56 pg/mL、40．78±4．13 pg/mL和52．10±5．22 pg/mL，整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=132．638，P＜0．001）；進(jìn)一步兩兩比較顯示，卒中組（P＜0．001）和PSD組（P＜0．001）均高于假手術(shù)組；PSD組高于卒中組（P=0．002）。

2．2 左側(cè)海馬IL-1β和TNF-α mRNA基因相對(duì)表達(dá)水平 3組大鼠左側(cè)海馬中IL-1β和TNF-α mRNA基因相對(duì)表達(dá)水平相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0．001）。進(jìn)一步兩兩對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β mRNA基因相對(duì)表達(dá)水平：卒中組（P＜0．001）和PSD組（P＜0．001）均高于假手術(shù)組；PSD組高于卒中組（P=0．002）。TNF-α mRNA基因相對(duì)表達(dá)水平：卒中組（P=0．028）和PSD組（P=0．003）均高于假手術(shù)組；PSD組高于卒中組（P=0．041）（表2）。

2．3 尼氏染色結(jié)果 光鏡下觀察到假手術(shù)組的神經(jīng)元形態(tài)飽滿，細(xì)胞壁完整，數(shù)量多而密集；卒中組和PSD組的神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，神經(jīng)元染色較淺，部分發(fā)生萎縮變形；PSD組與卒中組比較，基質(zhì)更為疏松，尼氏小體明顯減少（圖1）。

3 討論

IL-17A是由CD4+ T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞分泌的一種炎性因子，其可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等合成并釋放MMP-3、MMP-9等多種毒性物質(zhì)，還可促進(jìn)TNF-α的合成和釋放[12]。Liu等[13]對(duì)小鼠行MCAO，發(fā)現(xiàn)IL-17A水平增加會(huì)加重腦組織缺血缺氧損傷，認(rèn)為IL-17A過(guò)度表達(dá)通過(guò)Src-PP2B-mTOR途徑加重卒中神經(jīng)元損傷，抑制IL-17A可能對(duì)缺血性卒中有潛在的治療作用。González-Parra等[14]在對(duì)銀屑病小鼠的抑郁行為中發(fā)現(xiàn)IL-17A高表達(dá)，研究后發(fā)現(xiàn)IL-17A水平增高通過(guò)NFkB和p38MAPK信號(hào)通路參與小鼠抑郁的發(fā)生。在對(duì)抑郁癥研究中發(fā)現(xiàn)血清IL-17A水平增加和神經(jīng)遞質(zhì)改變有關(guān)，但抑郁癥嚴(yán)重程度與血液中IL-17A水平之間缺乏一致的相關(guān)性，這表明在應(yīng)激反應(yīng)中Th17細(xì)胞參與抑郁發(fā)生，但可能并不完全依賴于IL-17A[15]。上述研究表明IL-17A在卒中和抑郁中均有高表達(dá)，但作用通路不同。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，卒中組大鼠、PSD組大鼠的外周血IL-17A含量與假手術(shù)組大鼠相比升高，考慮與卒中后缺血缺氧引發(fā)細(xì)胞因子改變有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中大鼠腦缺血后以IL-1β和TNF-α等為代表的多種炎性介質(zhì)失控、釋放而形成“瀑布效應(yīng)”，引起神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、凋亡等，其中IL-17A出現(xiàn)異常表達(dá)水平升高。PSD組大鼠的IL-17A含量與卒中組相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮PSD組大鼠IL-17A升高不僅與卒中有關(guān)，也與大鼠抑郁癥狀有關(guān)。PSD組大鼠在卒中和抑郁雙重作用下，IL-17A水平最高，推測(cè)IL-17A在卒中和抑郁的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了作用。

海馬主要參與調(diào)節(jié)情緒、學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能，對(duì)缺血非常敏感，在對(duì)卒中小鼠研究中發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)含有大量的糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR），在應(yīng)激反應(yīng)下皮質(zhì)醇與GR結(jié)合可損傷海馬進(jìn)而產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙、情緒低下、失眠等癥狀[16]。研究表明缺血性卒中后受到CUMS可以引起HPA軸亢進(jìn)和促炎性細(xì)胞因子的水平升高，從而抑制海馬的神經(jīng)元再生，降低腦神經(jīng)可塑性最終導(dǎo)致PSD的發(fā)生[17]。在本研究中，不同組別大鼠左側(cè)海馬區(qū)的IL-1β、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量不同，其中卒中組高于假手術(shù)組，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮卒中后海馬缺血缺氧，大量炎癥因子參與，其中IL-1β、TNF-α表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高。PSD組的IL-1β、TNF-α表達(dá)升高最明顯，與假手術(shù)組、卒中組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明除了卒中所致炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)升高外，CUMS也可能引起HPA軸亢進(jìn)、炎癥因子升高，大鼠逐漸出現(xiàn)抑郁行為，推測(cè)大鼠海馬IL-1β、TNF-α高表達(dá)在卒中和抑郁的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了作用。

腦組織中大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧最為敏感[18]。方小霞等[19]經(jīng)研究認(rèn)為IL-17A缺陷可減輕T1DM小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞激活促發(fā)的神經(jīng)炎癥，進(jìn)一步減少神經(jīng)元凋亡。本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠腦組織切片后行尼氏染色，光鏡下假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色示神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊緊密，尼氏體豐富。卒中組大鼠CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)飽滿，但神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，總體排列不致密，且不整齊，基質(zhì)疏松、尼氏小體減少，說(shuō)明有神經(jīng)元損害，但神經(jīng)元損害相對(duì)較輕，與卒中因素有關(guān)。PSD組較卒中組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少、形態(tài)結(jié)構(gòu)異常、染色淺程度加重，大部分發(fā)生萎縮變形，尼氏體減少、基質(zhì)疏松，說(shuō)明PSD組損傷最重，卒中及致抑郁因素均參與了海馬CA1區(qū)損傷。

本研究顯示，PSD組大鼠血清IL-17A水平、海馬IL-1β和TNF-α mRNA基因相對(duì)表達(dá)升高，PSD的發(fā)生可能與炎癥因子有關(guān)系，為進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)在PSD發(fā)病機(jī)制中的作用提供了一定的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)仍存在不足：僅對(duì)IL-17A和海馬IL-1β、TNF-α mRNA與卒中和PSD的關(guān)系進(jìn)行研究，并未涉及其他相關(guān)影響因素，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將完善這些研究。

【點(diǎn)睛】卒中后抑郁大鼠血清IL-17A水平上調(diào)，海馬IL-1β、TNF-α mRNA高表達(dá)，卒中后抑郁發(fā)病機(jī)制中可能有炎癥因子參與。