曾勇波，馬海明

(1 寧鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南 寧鄉(xiāng) 410600；2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45(Growth Arrest and DNA Damage Inducible Gamma 45，GADD45G)是一類(lèi)重要的信號(hào)換能器，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能。GADD45G基因在人類(lèi)基因去甲基化方面研究較多，但該基因在豬上的研究極少。鑒于國(guó)內(nèi)外對(duì)豬GADD45G基因的研究甚少，我們開(kāi)展了寧鄉(xiāng)豬GADD45G基因分子遺傳特性研究，以便為揭示GADD45G基因?qū)ωi肉質(zhì)性狀的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇325頭大白豬和67頭寧鄉(xiāng)豬，采集豬耳小塊組織樣本，隨后提取DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增條件

正向引物為5＇-AAA CTT GCT GCT TGC G-3＇；反向引物為5＇-GGA TGG AGG CGA CAC T-3＇。

1.2.1 PCR反應(yīng)體系(總體積20 μL)

10×Buffer 2 μL，2 mmol/L dNTPs 1.6 μL，20 mmol/L MgCl21.6 μL，TaqDNA聚合酶 (5 U/μL)0.4 μL，DNA模板(100 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.4 μL，雙蒸蒸餾水(dd H2O) 12.6 μL。

1.2.2 PCR反應(yīng)程序

94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸8 min，最后4 ℃保存。

1.3 PCR產(chǎn)物Pst I酶切

在10 μL PCR產(chǎn)物中加入0.8 μL 10×內(nèi)切酶緩沖液、0.2 μL限制性內(nèi)切酶和1 μL雙蒸蒸餾水，總體積為12 μL，37 ℃消化4 h～10 h。

A/G位點(diǎn)用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，5 V/cm電壓電泳0.5 h(圖1)，擴(kuò)增片斷為第1外顯子至第2外顯子，共804 bp，為PCR-RFLP-PstI分子標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

在擴(kuò)增的804 bp的片斷中，GADD45G基因的PstI的酶切位點(diǎn)A/G位點(diǎn)存在3種基因型：AA型(804 bp)、AG型(164 bp+640 bp+804 bp)和GG型(164 bp+640 bp)。對(duì)GADD45G基因A/G位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率進(jìn)行檢測(cè)，PCR-RFLPPstI多態(tài)性的分布情況如表1所示，寧鄉(xiāng)豬GADD45G基因A/G位點(diǎn)均存在AA基因型、GG基因型以及AG基因型，AG基因型頻率較高，基因頻率分別為0.08、0.73和0.19；A基因和G基因的頻率分別為0.45和0.55，A/G位點(diǎn)的基因型大部分處于雜合狀態(tài)。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，寧鄉(xiāng)豬GADD45G基因A/G位點(diǎn)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，表明本研究結(jié)果可靠。本研究為寧鄉(xiāng)豬的保種和系統(tǒng)選育奠定了理論基礎(chǔ)。