王 瑞， 朱文清， 鄭 潔， 張國(guó)文*

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047)

許多蛋白質(zhì)或多肽在一些內(nèi)部(氨基酸序列變異、氧化應(yīng)激)，或者外部(極端pH、高溫)因素的共同作用下，會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，從而形成不溶性淀粉樣纖維。這些蛋白纖維會(huì)在體內(nèi)不斷沉積，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，對(duì)機(jī)體器官造成破壞和損傷，從而誘導(dǎo)帕金森氏癥、阿爾茨海默病以及Ⅱ型糖尿病等疾病的發(fā)生[1]。原兒茶酸(Protocatechuic Acid,PA)作為一種酚酸類化合物，廣泛存在于蔬菜和水果中，也是很多天然中草藥的有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗血糖、消炎、保護(hù)神經(jīng)等多種藥理學(xué)作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類化合物咖啡酸[3]、迷迭香酸[4]，以及黃酮化合物根皮素[5]、黃芩素[6]等均能顯著抑制蛋白淀粉樣纖維的形成。紫衫木素通過與蛋白質(zhì)的氨基酸如賴氨酸(Lys)殘基發(fā)生結(jié)合[7]，阻礙Aβ42蛋白的聚集，抑制了蛋白纖維化的生成。然而，關(guān)于原兒茶酸對(duì)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的抑制及可能的抑制機(jī)制目前仍不清楚。

本文以人血清白蛋白(HSA)為蛋白模型，采用熒光光譜、圓二色譜(CD)，結(jié)合透射電子顯微鏡(TEM)和分子模擬技術(shù)，研究了原兒茶酸對(duì)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的抑制作用及抑制機(jī)制，以期為天然酚酸化合物在食品工業(yè)中的應(yīng)用和藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

F-7000型熒光光度計(jì)(日本，日立公司)；MOS-450型圓二色譜儀(法國(guó)，Bio-Logic公司)；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本，電子光學(xué)公司)；BSA224S型電子天平(德國(guó)，賽多利斯公司)。

HSA(純度≥96%，北京索萊寶科技有限公司)；分別稱取一定量原兒茶酸(PA，純度≥97%，上海阿拉丁有限公司)、硫黃素T(ThT，純度75%，上海源葉生物科技公司)和8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS，純度96%，上海阿拉丁有限公司)用無(wú)水乙醇溶解，配制成濃度為2.0×10-2、2.0×10-2和1.0×10-4mol·L-1的儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱中避光保存；其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國(guó)密理博公司)制備的超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HSA淀粉樣纖維化的制備稱取適量的HSA溶解于pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol·L-1)中，配制成濃度為50 μmol·L-1的蛋白溶液，放置在4 ℃的冰箱中過夜以充分溶解。取不同體積的原兒茶酸儲(chǔ)備液加入到HSA蛋白溶液中，原兒茶酸的終濃度分別為250 μmol·L-1和500 μmol·L-1。將上述溶液充分混勻后，置于65 ℃的恒溫水浴鍋中孵育，分別在1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h時(shí)取樣，待測(cè)。

1.2.2 ThT熒光光譜測(cè)定向2 mL不同時(shí)間段取出的HSA樣品溶液中加入5 μL ThT儲(chǔ)備溶液，充分振蕩搖勻后，置于暗處反應(yīng)30 min，將反應(yīng)后的試液倒入熒光池中，在440 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，測(cè)定450～650 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm。

1.2.3 ANS熒光光譜測(cè)定將孵育后的HSA樣品用緩沖溶液稀釋至5.0 μmol·L-1后，加入一定體積的ANS儲(chǔ)備溶液，保證ANS與蛋白的濃度比為10∶1，避光反應(yīng)30 min后，測(cè)定ANS熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為380 nm，掃描范圍為400～600 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm。

1.2.4 CD測(cè)定采用CD儀測(cè)定HSA溶液孵育前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。在室溫條件下，將稀釋的蛋白溶液(5.0 μmol·L-1)加入到石英比色皿中進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)掃描范圍為190～250 nm，每組樣品測(cè)量3次，通過扣除緩沖溶液的背景光譜來(lái)校正所測(cè)得的CD光譜。

1.2.5 TEM測(cè)定將孵化前后的HSA溶液用緩沖液稀釋到5.0 μmol·L-1，輕微振蕩后使其分散均勻，取20 μL稀釋后的HSA溶液滴于帶有碳支撐膜的銅網(wǎng)上，靜置蒸發(fā)干燥后，滴加1%磷鎢酸負(fù)染5 min，用濾紙吸去多余的磷鎢酸，于37 ℃干燥箱中過夜。采用TEM觀察蛋白纖維化程度。

1.2.6 分子模擬使用AutoDock 4.2和MGLTools 1.5.6軟件模擬原兒茶酸與HSA的結(jié)合模式。配體分子原兒茶酸的3D結(jié)構(gòu)通過Chem3D Ultra 8.0軟件構(gòu)建，并進(jìn)行能量最小優(yōu)化。HSA的晶體結(jié)構(gòu)從Protein Data Bank網(wǎng)站下載(1h9z)，除去HSA的水分子，并將極性氫原子加入到HSA中。將處理好的原兒茶酸與HSA進(jìn)行分子對(duì)接，并應(yīng)用Lamarckian遺傳算法完成對(duì)接計(jì)算，對(duì)接次數(shù)為100次，運(yùn)行結(jié)束后，形成一系列的能量簇，根據(jù)能量最優(yōu)原則選擇最合適的對(duì)接模型進(jìn)行結(jié)果分析。

圖1 (A)不同濃度原兒茶酸存在下HSA淀粉樣蛋白聚集的ThT熒光動(dòng)力學(xué)；(B)65 ℃孵育120 h后HSA纖維化的ThT熒光光譜Fig.1 (A) ThT fluorescence kinetics of HSA in the absence and presence of difference concentrations of PA;(B) ThT fluorescence spectra of HSA fibrillation after incubation at 65 ℃ over 120 h in the absence and presence of PA

2 結(jié)果與討論

2.1 原兒茶酸對(duì)HSA淀粉樣纖維聚集的抑制

ThT作為一種陰離子熒光染料，能夠與淀粉樣纖維的β片層結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，在440 nm波長(zhǎng)激發(fā)條件下產(chǎn)生熒光，ThT熒光值的大小常被用作評(píng)估蛋白淀粉樣纖維程度的指標(biāo)[8]。如圖1(A)所示，不同于大多數(shù)蛋白質(zhì)纖維化過程呈現(xiàn)出的核依賴聚集模型，HSA的纖維化過程不包括成核期[9]，直接形成原纖維并結(jié)合捆綁形成成熟的淀粉樣纖維(生長(zhǎng)期，0～84 h)，當(dāng)體系中所有的蛋白質(zhì)單體均轉(zhuǎn)化為成熟淀粉樣纖維后，ThT的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定(穩(wěn)定期，84～120 h)，孵化120 h后的ThT熒光強(qiáng)度為304.8(圖1(B)曲線1)。加入不同濃度的原兒茶酸與HSA孵化后可明顯降低蛋白淀粉樣纖維的生成量，當(dāng)原兒茶酸的濃度為250 μmol·L-1和500 μmol·L-1時(shí)，ThT熒光強(qiáng)度分別降低至174和122.7(圖1(B)曲線2、3)，對(duì)HSA淀粉樣纖維形成的抑制率分別達(dá)到了42.5%和59.5%。該結(jié)果初步證明了原兒茶酸對(duì)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的形成有良好的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。

2.2 原兒茶酸對(duì)HSA淀粉樣纖維表面疏水性的影響

研究表明，蛋白質(zhì)在不斷聚集形成纖維化的過程中，常伴隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的部分解折疊，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性氨基酸的暴露[10]。ANS作為一種典型的疏水性探針，本身熒光強(qiáng)度較弱，當(dāng)其作用于蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸，其熒光強(qiáng)度會(huì)顯著增強(qiáng)[11]。如圖2所示，25 ℃下HSA-ANS體系熒光強(qiáng)度較低(119.3，曲線1)，說明常溫下HSA內(nèi)部疏水性氨基酸不會(huì)暴露出來(lái)，而在65 ℃孵化120 h后的HSA-ANS體系熒光強(qiáng)度明顯升高(651.9，曲線2)，并伴隨著顯著的藍(lán)移(486 nm→479 nm)，表明孵化后的HSA表面暴露出較多的疏水性氨基酸殘基。當(dāng)在整個(gè)蛋白質(zhì)孵化體系(65 ℃,120 h)中加入濃度為250和500 μmol·L-1的原兒茶酸后，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度為374.4(曲線3)和264(曲線4)，分別降低了42.6%和59.5%。該結(jié)果表明原兒茶酸誘導(dǎo)了HSA多肽鏈的收縮，從而即便在較高溫度下(65 ℃)也能維持蛋白質(zhì)正常的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。有文獻(xiàn)報(bào)道，小分子與蛋白質(zhì)的非共價(jià)結(jié)合能夠穩(wěn)定淀粉樣纖維蛋白的核心結(jié)構(gòu)[12]，因此，我們推測(cè)原兒茶酸可能與HSA的氨基酸殘基發(fā)生非共價(jià)結(jié)合而抑制了HSA纖維的形成。

2.3 原兒茶酸對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

研究表明，在正常蛋白向成熟的淀粉樣纖維變化過程中，伴隨著蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變[13]。圖3顯示未經(jīng)孵化的HSA在208 nm和222 nm處有兩個(gè)明顯的特征吸收峰，表明在HSA結(jié)構(gòu)中α-螺旋占主導(dǎo)地位。當(dāng)HSA在65 ℃下孵化120 h后，HSA在222 nm處的吸收峰消失，強(qiáng)度減弱，表明HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變[14]。當(dāng)向上述孵化的HSA溶液中加入原兒茶酸后，HSA的CD光譜橢圓度逐漸恢復(fù)，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，表明原兒茶酸的加入能夠阻止蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，原兒茶酸通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)而發(fā)揮其抑制淀粉樣纖維作用[14]。

圖2 不同濃度原兒茶酸在65 ℃下孵化120 h后對(duì)HSA表面疏水性的影響Fig.2 Effect of difference concentrations of PA on the surface hydrophobicity of HSA after incubation at 65 ℃ for 120 hcurves 1 - 4:1.HSA at 25 ℃(5.0 μmol·L-1);2.HSA at 65 ℃(5.0 μmol·L-1) for 120 h;3.HSA+PA(250 μmol·L-1) at 65 ℃ for 120 h;4.HSA+PA(500 μmol·L-1) at 65 ℃ for 120 h.

圖3 不同濃度原兒茶酸在65 ℃下孵化120 h后對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of difference concentrations of PA on the secondary structure of HSA after incubation at 65 ℃ for 120 h

采用在線的Dichroweb軟件分析[15]得到HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量(表1)。由表可以看出，孵化后的HSA中α-螺旋含量明顯降低(46.9%→37.9%)，β-折疊含量顯著增大(2.1%→11.6%)，而加入原兒茶酸(500 μmol·L-1)與HSA共同孵化后，α-螺旋含量從37.9%恢復(fù)到43.3%，β-折疊含量也從11.6%降低到5.3%，進(jìn)一步證實(shí)了原兒茶酸具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的能力，這也可能是其能夠抑制蛋白淀粉樣纖維化的原因之一。

表1 HSA和原兒茶酸-HSA體系的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

2.4 原兒茶酸對(duì)HSA淀粉樣纖維形態(tài)的影響

為了更直觀的觀察HSA淀粉樣纖維化的形成以及評(píng)估原兒茶酸對(duì)蛋白淀粉樣纖維化的抑制效果，采用TEM觀察HSA溶液中蛋白的形態(tài)變化[16]。如圖4A所示，常溫下的HSA溶液中未觀察到纖維的形成，經(jīng)過65 ℃孵化120 h的蛋白溶液則形成了直的成熟淀粉樣纖維，并產(chǎn)生聚集形成濃密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖4B)。在加入原兒茶酸孵化后該蛋白溶液的纖維化程度明顯減弱，當(dāng)加入的原兒茶酸濃度達(dá)到500 μmol·L-1時(shí)，幾乎觀測(cè)不到明顯的纖維狀蛋白，原兒茶酸與蛋白結(jié)合形成了顆粒狀的聚集體(圖4C和4D)。TEM結(jié)果與ThT熒光測(cè)量結(jié)果相符，證實(shí)原兒茶酸具有良好的抑制蛋白淀粉樣纖維形成的能力。

圖4 HSA淀粉樣纖維的TEM圖像(200 nm).(A) 25 ℃的HSA;(B) 65 ℃孵化120 h的HSA;(C) HSA+PA(250 μmol·L-1) 65 ℃孵化120 h;(D) HSA+PA(500 μmol·L-1) 65 ℃孵化120 hFig.4 TEM images of HSA amyloid fibrils(200 nm).(A) HSA at 25 ℃;(B) HSA incubated at 65 ℃ for 120 h;(C) HSA+PA(250 μmol·L-1) incubated at 65 ℃ for 120 h;(D) HSA+PA(500 μmol·L-1) incubated at 65 ℃ for 120 h

2.5 原兒茶酸與HSA分子對(duì)接

原兒茶酸與HSA分子對(duì)接顯示，原兒茶酸進(jìn)入了HSA子域ⅢB和子域ⅠB之間的疏水空腔(圖5(A))，被Glu184,Arg186,Asp187,Lys190,Arg428,Lys432,Ser435,Lys436,Lys519,Gln522,Ile523,Gln526和Thr527等氨基酸殘基包圍，且分別與Lys432和Lys519形成兩個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)分別為2.202 ?和2.234 ?(圖5(B))，表明原兒茶酸通過氫鍵和疏水作用力與HSA發(fā)生結(jié)合，這種結(jié)合有助于維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，阻礙蛋白質(zhì)的聚集，從而抑制蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的形成。Sato等[7]報(bào)道，兒茶酚型黃酮類化合物紫杉葉素通過結(jié)合Aβ42的賴氨酸殘基(Lys)而抑制Aβ42多肽的聚集。由此推測(cè)原兒茶酸可能與紫杉葉素類似，通過與賴氨酸殘基特異性結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)聚集和淀粉樣纖維化的形成。

圖5 (A) 原兒茶酸與HSA最可能結(jié)合位點(diǎn)；(B) HSA疏水性空腔中與原兒茶酸作用的氨基酸殘基Fig.5 (A) The most possible binding site of PA in HSA;(B) Interaction of PA with the amino acid residues in the hydrophobic pocket of HSA

3 結(jié)論

原兒茶酸對(duì)HSA淀粉樣纖維化的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)濃度為500 μmol·L-1時(shí)，其抑制率達(dá)到了59.5%。原兒茶酸主要通過氫鍵和疏水作用力與HSA發(fā)生結(jié)合，減少蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸的暴露，使得蛋白質(zhì)在較高溫環(huán)境(65 ℃)下也能夠維持正常的構(gòu)象。原兒茶酸可能通過與HSA中的賴氨酸殘基的特異性結(jié)合而穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制蛋白質(zhì)聚集，減少淀粉樣纖維化的形成。該研究結(jié)果可為原兒茶酸作為新型抗淀粉樣蛋白抑制劑的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。