姚蘊恒， 吳信子， 白龍律， 田海峰， 任秀麗

(1.延邊朝鮮族自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，吉林延吉 133000；2.延邊大學工學院，吉林延吉 133002)

人參(Ginseng)作為一種珍貴的中草藥，主產(chǎn)于中國、韓國、日本等東亞國家[1]。由于藥用價值極高，人們對其藥理和生物活性進行廣泛研究[2]。其成分不僅能夠提高人體免疫能力，而且對神經(jīng)類疾病、糖尿病、心血管類疾病等有良好的治療和預防效果[3 - 5]。眾所周知，人參的生長周期一般在5至6年，有的甚至10年。這樣一個長周期的種植與農(nóng)藥的使用是必不可分的，其中以除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、發(fā)芽抑制劑為主，它們的使用可以保護人參免受病菌、雜草與害蟲的破壞[6]。然而，不合理的使用農(nóng)藥可能導致部分農(nóng)藥沒有被利用而直接遷移到土壤當中。由于農(nóng)藥固有的高毒性和難降解性，在土壤中的殘留長期積累不僅會對環(huán)境和公共衛(wèi)生造成巨大威脅，而且不利于重茬種植[7]。其高毒性會直接干擾人體各重要器官的功能，最終導致呼吸麻痹和死亡[8]。因此，發(fā)展敏捷、可靠的分析方法檢測人參種植土壤中農(nóng)藥殘留是人身健康、環(huán)境安全的重要保障。

土壤是由礦物質(zhì)、有機質(zhì)、水、空氣及微生物等多組分構成的復雜體系，因此，如何去除基質(zhì)干擾是當前面臨的主要問題。目前，樣品前處理的主要方法有液-液萃取法[9]、索氏提取法[10]、加速溶劑萃取法[11]、固相萃取法(SPE)[12]、QuEChERS法[13，14]。SPE是眾多前處理方法中使用最多的一種，該方法操作簡便、提取率高、溶劑消耗量少且固相萃取柱能夠最大限度的除去基質(zhì)干擾。目前，關于人參種植土壤中農(nóng)藥殘留分析的報道較少，且主要以氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)為檢測手段。近年來，隨著農(nóng)藥殘留檢測技術的快速發(fā)展，氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用技術憑借抗干擾能力強、應用范圍廣等優(yōu)勢，已經(jīng)成為痕量分析的首選[15，16]。本文采用固相萃取法，結合GC/MS聯(lián)用技術，建立了一種人參種植土壤中48種農(nóng)藥殘留的檢測方法。該方法靈敏度高、準確性好，適合批量樣品檢測，有很強的實用意義，為人參種植土壤中農(nóng)藥殘留的檢測開辟了新途徑。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

TSQ 8000 Evo氣/質(zhì)聯(lián)用儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)；KQ3200型超聲波振蕩儀(昆山市超聲儀器有限公司)；EVA 50A型多功能樣品濃縮儀(北京普立泰科儀器有限公司)。固相萃取柱：NH2(1 000 mg/6mL)、C18(2 000 mg/12mL)、Florisil(1 000 mg/6mL)、PestiCarb(500 mg/6mL)均購于Agela Technologies(天津(中國))。

48種農(nóng)藥的標準溶液(100 μg/mL)購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所。用正己烷分別將各標準溶液稀釋10倍，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的單標儲備液，儲存于4 ℃冰箱中，備用。分別準確吸取適量單標儲備液，用正己烷稀釋定容，制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量溶度均為1.0 mg/L的混合標準儲備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。乙腈、石油醚、丙酮、二氯甲烷、甲醇、正己烷(色譜純，美國Fisher Chemical公司)；NaCl(優(yōu)級純，天津科密歐化學試劑有限公司)。水(色譜純，德國CNW Technologies公司)。

1.2 色譜/質(zhì)譜條件

色譜條件：TG -5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm；美國Thermo Fisher Scientific公司)。進樣口溫度為290 ℃。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持1 min；然后以30 ℃/min升至130 ℃；再以5 ℃/min升至250 ℃；最后以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；載氣：氦氣(純度≥99.999%)；恒流模式，流速為1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：2 μL；總運行時間為38 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(EI)；轟擊能量：70 eV；接口溫度：220 ℃；離子源溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；碰撞氣：氬氣(純度≥99.999%)；溶劑延遲時間：5 min；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(SIM)模式。Xcalibur工作站軟件用于儀器控制與數(shù)據(jù)處理。48種農(nóng)藥的保留時間、定量離子和定性離子見表1。

表1 48種農(nóng)藥的相對分子質(zhì)量、保留時間、定量離子和定性離子

(續(xù)表1)

No.PesticideMolecular weightRetention time(min)Quantitative ions(m/z)Qualitative ions(m/z)29Procymidone284.1421.62283285,25530Methidathion302.3321.89145157,30231Butachlor311.8622.45176160,18832Isprothiolane290.4023.01290231,20433p,p'-DDE318.0323.19318316,246,24834Nitrofen284.0923.98283253,202,13935p,p'-DDD320.0424.73235237,199,16536o,p'-DDT354.4924.82235237,165,19937Triazophos313.0125.41161172,25738p,p'-DDT354.4926.05235237,246,16539Trifloxystrobin408.3726.18116131,22240Phenylphosphonothioate323.3127.93157169,18541Bifenthrin422.8728.05181166,16542Fenpropathrin349.1728.26265181,34943Tetradifon356.0528.80227356,15944Permethrin391.2930.86,31.05183184,25545Coumaphos362.7831.18362226,364,33446Flucythrinate451.4632.39,32.63199157,18147Fluvalinate502.9033.50,33.58250252,18748Deltamethrin505.2434.22181172,174

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取人參種植土壤樣品為延邊地區(qū)的某人參種植基地隨機采取的土壤，取樣品200 g置于均質(zhì)機中攪拌，干燥，備用。準確稱取10 g(精確至0.01 g)攪拌混勻的樣品至250 mL離心瓶中，用2 mL水潤濕，加入50 mL乙腈，加入5 g NaCl；旋好蓋子后，室溫下(25 ℃)超聲振蕩20 min，3 500 r/min離心5 min；移取有機層溶液10 mL至150 mL雞心瓶中，40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2 mL甲醇-二氯甲烷(體積比為1∶19)溶解殘渣(必要時可渦旋混合)，所得溶液待凈化。

1.3.2 凈化固相萃取柱用5 mL二氯甲烷活化，將上述提取液過柱，再依次用5 mL、5 mL、5 mL甲醇-二氯甲烷(體積比為1∶19)過柱，所得的洗脫液40 ℃水浴中氮吹至干，向其中加入2 mL正己烷復溶，并過0.22 μm有機相濾膜，裝瓶，待測。

1.4 共萃取基質(zhì)的測定

基質(zhì)匹配混合標準溶液按照“1.3”節(jié)步驟提取不含目標化合物的“空白”樣品，獲得的提取液為稀釋溶劑，制備成系列質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25 μg/mL的基質(zhì)匹配標準溶液。

通過質(zhì)量測定法來考察使用不同萃取劑最終所得的提取液中共萃取基質(zhì)的含量，萃取劑提取后未凈化的萃取液為初級萃取液，凈化后的萃取液為最終萃取液。分別將2 mL初級萃取液和最終萃取液置于10 mL已稱重的離心管中，氮氣吹干后于80 ℃干燥1 h，冷卻后至恒重，與原離心管重量之差即為共萃取基質(zhì)的含量。

2 結果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

48種農(nóng)藥的分子極性相對較弱，因此選擇極性較小的TG -5MS石英毛細管色譜柱進行分離。首先進行全掃描以獲得48種農(nóng)藥的保留時間和質(zhì)譜圖；再根據(jù)質(zhì)譜圖選擇質(zhì)荷比較大、強度較高的特征離子作為監(jiān)測離子。經(jīng)反復優(yōu)化，確定48種農(nóng)藥的保留時間、定量離子和定性離子(表1)。在上述優(yōu)化條件下，48種農(nóng)藥標準溶液(50 μg/kg)的總離子流色譜圖見圖1，可以看出48種農(nóng)藥的色譜峰形好且被較好分離。

圖1 48種農(nóng)藥混合標準溶液(50 μg/kg)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of a mixed standard solution of the 48 pesticides(50 μg/kg)

圖2 采用乙腈、乙酸乙酯、丙酮3種萃取劑的初級萃取液和最終萃取液中共萃取基質(zhì)的含量Fig.2 Amounts of co-extractives in initial and final extract obtained with three extractant：acetonitrile,ethyl acetate and acetone

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇選擇合適的萃取劑可以在提高目標物萃取效率的同時降低基質(zhì)干擾。本研究比較了乙腈、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、丙酮∶石油醚=1∶1(V/V)的提取效果。結果顯示：當石油醚和丙酮∶石油醚=1∶1(V/V)作為萃取劑時，回收率較低且對目標物離子化抑制較強；而乙腈、乙酸乙酯、丙酮的提取回收率相對較高。根據(jù)質(zhì)量測定法測定共萃取基質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)提取出的雜質(zhì)質(zhì)量依次為丙酮>乙酸乙酯>乙腈(圖2)，相比之下，乙腈作為萃取劑的共萃取基質(zhì)含量最少，說明基質(zhì)效應相對最弱。綜合考慮，本研究選擇乙腈作為萃取劑。

2.2.2 固相萃取柱的選擇目前，固相萃取法中常用的固相萃取柱有NH2、C18、Florisil、PestiCarb等。本文考察了NH2、C18、Florisil、PestiCarb固相萃取柱的凈化效果，結果如圖3。PestiCarb固相萃取柱去除雜質(zhì)的效果最好，但因為其吸附能力較強而導致部分農(nóng)藥的損失較大；其中，六氯苯、百菌清、五氯苯胺三種農(nóng)藥被完全去除，無法被檢測到，因此不適用于本研究的農(nóng)藥殘留分析。通過比對過柱后樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)經(jīng)C18和Florisil固相萃取柱處理后，仍存在一些雜質(zhì)峰，說明凈化效果依次為NH2>Florisil>C18。綜合考慮，本文最終選擇NH2固相萃取柱凈化。

圖3 4種固相萃取柱對土壤中48種農(nóng)藥凈化效果的影響Fig.3 The effect of purification efficiency for 48 pesticides by four solid phase extraction columns in soil

2.2.3 洗脫劑和洗脫體積的選擇本文考察了不同比例的甲醇-二氯甲烷(1∶9、1∶14、1∶19、1∶24,V/V)作為洗脫劑對48種農(nóng)藥回收率的影響。結果表明：四種比例洗脫劑的農(nóng)藥回收率相當，相比之下甲醇-二氯甲烷(1∶19,V/V)作為洗脫劑時，平均回收率在70%～120%范圍的農(nóng)藥數(shù)量最多。本實驗同時對洗脫劑體積(5、10、15、20 mL)進行了考察。分別收集各體積的洗脫流出液，將其濃縮、定容后進行GC/MS測定，計算48種農(nóng)藥的回收率。結果表明，隨著洗脫劑體積的增加，48種農(nóng)藥的回收率逐漸增大，當洗脫劑體積為15 mL時，農(nóng)藥的回收率最高；而繼續(xù)增加洗脫劑用量，農(nóng)藥的平均回收率趨于恒值。因此，最終確定選擇15 mL甲醇-二氯甲烷(1∶19,V/V)洗脫NH2固相萃取柱。

2.3 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應(Matrix Effect，ME)是指樣品中分析物以外的組分對分析物分析過程的離子化而產(chǎn)生的抑制與增強作用[17]?；|(zhì)效應=基質(zhì)匹配工作曲線的斜率/純?nèi)軇┲泄ぷ髑€的斜率，比值越接近1，則基質(zhì)效應越小，反之則基質(zhì)效應越大。48種農(nóng)藥目標物在采用“1.3”節(jié)前處理方法得到的萃取液中的基質(zhì)效應見表2。48種農(nóng)藥化合物中毒死蜱、三唑磷、苯硫磷、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、o，p′-滴滴涕、p，p′-滴滴涕的基質(zhì)效應最為明顯。目前，常見的降低基質(zhì)效應的方法有：同位素內(nèi)標法、基質(zhì)匹配標準曲溶液、基質(zhì)凈化法等；相比之下，基質(zhì)匹配標準溶液不僅效果較好，而且具有操作簡單、廉價的優(yōu)點。因此，本文采用基質(zhì)匹配標準溶液進行校正。

表2 48種農(nóng)藥在土壤中的基質(zhì)效應

*The number and names of pesticides are identical to those in Table 1.

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的標準曲線、檢出限和定量限本實驗采用空白土壤樣品的基質(zhì)提取液，配制質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50、100、250 μg/kg系列基質(zhì)匹配混合標準溶液，按照“1.2”節(jié)的條件進樣測定。以峰面積(y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標制作標準曲線，結果如表3。48種農(nóng)藥在各自的線性范圍內(nèi)，線性關系良好，相關系數(shù)(r2)均大于0.995。以信噪比(S/N)為3和10時空白樣品添加濃度計算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)(表3)，檢出限和定量限的范圍分別為2.0～6.0 μg/kg和5.0～20.0 μg/kg。

表3 48種農(nóng)藥的回收率、相對標準偏差、檢出限、定量限、線性方程、線性范圍及相關系數(shù)

(續(xù)表3)

No.*Recovery(RSD)(%,n=6)10 μg/kg20 μg/kg100 μg/kgLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)RegressionequationLinear range(μg/kg)r21299.5(7.8)88.7(4.2)103.7(9.2)2.05.0Y=34 449 518x-333 5355-2500.998913103.3(5.7)117.4(11.2)115.5(9.0)3.010.0Y=21 704 261x-218 42710-2500.997714-96.5(8.3)105.9(14.4)6.020.0Y=21 312 578x-95 41020-2500.99881595.6(4.7)110.9(10.8)97.9(10.0)3.010.0Y=37 669 614x-548 92710-2500.99751693.1(7.6)94.5(2.8)115.7(9.2)3.010.0Y=65 327 422x-36 33910-2500.999117101.0(8.4)91.2(5.2)114.0(8.3)3.010.0Y=31 999 946x-224 09210-2500.99931897.2(3.8)93.1(5.9)109.3(5.8)3.010.0Y=38 447 703x-408 53310-2500.998719102.5(2.7)95.3(4.3)88.0(10.6)2.05.0Y=126 413 945x-1 273 4775-2500.99882094.3(4.6)99.6(5.6)111.4(8.1)2.05.0Y= 28 860 702x-200 3415-2500.999321114.9(11.0)104.9(6.3)95.9(11.3)2.05.0Y=5 166 5857x-42 3925-2500.999122103.0(8.1)102.6(7.7)128.8(13.3)3.010.0Y= 49 880 132x+811 06910-2500.99612396.2(8.1)89.7(3.2)111.1(14.0)3.010.0Y=13 749 227x-75 47810-2500.999024-91.2(11.9)106.5(9.9)6.020.0Y= 55 428 047x-380 21420-2500.996925111.3(5.7)92.9(12.5)112.2(11.8)3.010.0Y=19 890 174x-4707310-2500.997126101.1(4.4)92.9(7.3)115.9(7.9)3.010.0Y=22 792 717x-177 83110-2500.999127107.0(2.3)101.0(3.9)109.3(9.5)2.05.0Y=46 313 434x-544 9805-2500.998328106.4(11.0)96.8(6.3)112.7(8.2)2.05.0Y=58 951 428x-165 8885-2500.99572989.5(8.6)93.3(8.5)109.2(7.2)2.05.0Y=21 670 980x-75 9945-2500.99623099.1(7.0)87.8(4.9)107.0(8.7)3.010.0Y=28 127 943x-337 65610-2500.99843198.2(7.5)93.1(4.8)116.4(9.9)2.05.0Y=51 707 957x-13 0675-2500.99883295.6(7.1)94.2(6.7)107.7(10.4)3.010.0Y=23 385 997x-113 11310-2500.99653398.6(2.3)98.8(8.5)115.6(9.6)2.05.0Y=103 449 277x-245 1205-2500.99693496.5(1.5)93.8(6.3)114.6(6.7)2.05.0Y=37 195 539x-332 6845-2500.99903598.3(5.4)95.0(5.9)99.9(11.5)2.05.0Y=118 995 982x-951 4055-2500.999336114.5(4.8)105.3(4.0)92.4(14.6)2.05.0Y=43 336 437x-474 2975-2500.997337100.7(8.4)89.7(4.2)108.5(11.6)3.010.0Y=26 115 835x-329 32110-2500.99793896.0(4.0)110.8(3.7)102.3(13.8)2.05.0Y=35 093 408x+112 1975-2500.999339105.1(10.3)90.5(4.3)108.2(9.5)2.05.0Y=49 869 480x-279 5225-2500.999240115.2(3.6)110.2(8.8)116.2(11.2)3.010.0Y=38 209 648x-482 87310-2500.998141-89.6(8.9)93.8(10.3)6.020.0Y=190 870 959x-1 148 38420-2500.997242101.2(2.8)94.0(4.8)112.1(12.0)3.010.0Y=39 261 272x-311 55010-2500.99814394.4(4.8)96.9(9.4)109.6(10.0)2.05.0Y=22 702 546x-79 3405-2500.996044105.5(8.4)97.3(10.6)104.6(5.1)3.010.0Y=35 222 601x-219 77310-2500.99704594.7(8.7)93.5(10.0)89.9(13.4)2.05.0Y=7 545 870x-82 9955-2500.996846115.1(9.3)109.1(13.4)113.3(12.3)3.010.0Y=23 615 854x-4 30210-2500.996547113.5(7.3)89.1(13.8)115.6(12.4)3.010.0Y=15 649 248x-4 72610-2500.998248119.7(3.5)103.5(9.6)110.1(12.7)3.010.0Y=5 128 968x+20 33810-2500.9986

*The number and names of pesticides are identical to those in Table 1.

2.4.2 方法的精密度和準確度本文采用基質(zhì)匹配標準溶液-外標法定量，在無農(nóng)藥殘留的人參土壤空白基質(zhì)中添加48種混合農(nóng)藥進行回收率實驗。準確稱取10.0 g均質(zhì)的人參土壤樣品于100 mL離心管中，分別添加低(10 μg/kg)、中(20 μg/kg)、高(100 μg/kg)3個水平的標準品。分別按照“1.2”節(jié)和“1.3”節(jié)所述的步驟進行樣品前處理和測定，每個添加水平重復6次。由表3可見，48種農(nóng)藥的加標回收率在86.3%～128.8%范圍內(nèi)，相對標準偏差(RSD)小于20%。

2.5 實際樣品檢測

為驗證方法的可靠性，采用本文建立的分析方法對延邊地區(qū)內(nèi)5個人參種植基地隨機采取的20份土壤樣品進行測定。結果表明，農(nóng)藥檢出率為5%；其中，五氯硝基苯檢出1份，含量0.19 mg/kg。其它土壤樣品中均未檢測出本文涉及到的48種農(nóng)藥殘留。

3 結論

本文建立了同時測定人參種植土壤中48種農(nóng)藥殘留的SPE-GC/MS分析方法。采用優(yōu)化的SPE方法凈化，能夠有效的除去人參土壤中的礦物質(zhì)、有機質(zhì)等雜質(zhì)干擾。在優(yōu)化的GC/MS條件下，色譜圖中48種農(nóng)藥色譜峰分離度好且基線平穩(wěn)。方法學驗證了該分析方法的各種參數(shù)(加標回收率、RSD、LOD、LOQ)均能夠滿足國內(nèi)對農(nóng)藥殘留檢測中精密度和準確度的要求。該方法操作簡單、高效、靈敏可靠，為人參種植土壤中多種類農(nóng)藥殘留的風險評估、例行檢測等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。