林 濤， 李茂萱， 鄒艷虹， 趙金化， 范澤劍， 邵金良*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 云南昆明 650205；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(昆明), 云南昆明 650205；3.云南省大理市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站， 云南大理 671000)

丙烯酰胺是目前國際上公認(rèn)的二類致癌物之一[1]，它具有神經(jīng)毒性[2]、遺傳毒性[3]、生殖毒性[4]及各種潛在致癌性[5，6]。研究表明，淀粉類食品在高于120 ℃的溫度下烹調(diào)下會產(chǎn)生丙烯酰胺[7]，因此，在炸薯條、炸土豆片等高溫下油炸食品中常檢出丙烯酰胺[8]，而近年來的相關(guān)研究也主要集中于丙烯酰胺的形成和抑制機(jī)理等方面[9，10]。目前，對于咖啡中丙烯酰胺的研究較少，少量文獻(xiàn)報道主要集中于咖啡中丙烯酰胺形成機(jī)理[11]、膳食評估等[12]，而咖啡中丙烯酰胺含量的測定方法也較少。咖啡中成分復(fù)雜、干擾物較多，測定過程中的難度較大，目前還沒有成熟可靠、快速準(zhǔn)確的方法，現(xiàn)在常見的方法主要包括了酶聯(lián)免疫分析法[13]、液相色譜法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]。近年來，隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的廣泛使用，該方法也應(yīng)用于咖啡中丙烯酰胺的測定，其測定結(jié)果靈敏度較高。但是由于前處理過程中通常都需要利用固相萃取柱凈化，其前處理時間較長，耗時費力[16]。

QuEChERS方法是目前常用的樣品前處理方法，而丙烯酰胺因其極性較大，采用常規(guī)QuEChERS方法的提取液中雜質(zhì)較多，不便于后續(xù)的凈化過程。因此，如何尋找簡便快捷且能夠普遍使用的咖啡中丙烯酰胺提取方法，是目前咖啡中丙烯酰胺測定的主要問題。本研究擬在現(xiàn)有的研究方法基礎(chǔ)上，采用改進(jìn)的QuEChERS方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，以期建立快捷、簡便的咖啡中丙烯酰胺的快速提取和測定方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

API4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，AB Sciex公司)；1290超高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)；BSA124S電子分析天平(德國，Sartorius公司)。

丙烯酰胺(純度99%，中國百靈威科技有限公司)；丙烯酰胺同位素內(nèi)標(biāo)(1,2,3-13C3)(純度99%，1 mg/mL，中國百靈威科技有限公司)。乙酸乙酯、乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；K4[Fe(CN)6]、NaCl、NH4Ac(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸、甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；石墨化炭黑(GCB)吸附劑(45 μm，美國Sigma公司)；硅藻土吸附劑(Chromosorb G -HP)(北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心)。純凈水(杭州娃哈哈公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制用乙腈分別將丙烯酰胺和丙烯酰胺同位素內(nèi)標(biāo)稀釋為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再分別用乙腈稀釋得到1 μg/mL的丙烯酰胺工作溶液和10 μg/mL的丙烯酰胺同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液，于-18 ℃下低溫避光保存。

1.2.2 樣品前處理準(zhǔn)確稱取1.00 g經(jīng)干燥粉碎后的咖啡樣品，置于50 mL離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)0.1 mL，加入15 mL正己烷，渦旋振蕩5 min后，6 000 r/min下離心2 min，棄上層正己烷溶液，再加入10 mL 0.1 mol/L K4[Fe(CN)6]溶液，渦旋振蕩5 min后，超聲提取10 min，6 000 r/min下離心10 min后，取上層溶液2 mL于另一15 mL離心管中，加入400 mg硅藻土吸附劑，渦旋混勻后加入5 mL乙酸乙酯，再加入50 mg GCB吸附劑，渦旋混勻后，6 000 r/min下離心2 min，上清液氮氣吹干后，用乙腈定容至1 mL，0.22 μm濾膜過濾后，待分析。

1.2.3 色譜條件CAPCELL CORE PC色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm；日本Shiseido公司)；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液(含1 mmol/L NH4Ac)，流速：0.2 mL/min，采用等度洗脫方式，洗脫比例為A+B=95%+5%；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件采用ESI源，正離子掃描模式，其中氣簾氣流速為20 L/h，霧化氣流速為55 L/h，輔助氣流速為55 L/h，輔助加熱氣溫度為650 ℃，噴霧電壓為5 500 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究中采用0.1 μg/mL的丙烯酰胺，分別在正、負(fù)離子模式下對其進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，但是丙烯酰胺在負(fù)離子模式下響應(yīng)較差，因此，采用正離子模式，并參照文獻(xiàn)報道[17，18]進(jìn)行離子對及相關(guān)電壓的優(yōu)化，確定丙烯酰胺測定的離子對條件，如表1所示。

表1 丙烯酰胺的監(jiān)測離子及相關(guān)電壓

*Quantitative ion.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

丙烯酰胺屬于小分子化合物，含有一個酰胺鍵，極性較大，因此實驗采用了對極性化合物具有特殊保留行為的親水色譜柱，采用乙腈+水=95%+5%等度洗脫，出峰時間在1 min左右，峰形較好，且采用高比例的有機(jī)相時也能夠提高質(zhì)譜的離子化效率。優(yōu)化條件下丙烯酰胺色譜圖見圖1。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)(a)、丙烯酰胺同位素內(nèi)標(biāo)(b)和咖啡空白基質(zhì)加標(biāo)(c)色譜圖Fig.1 Chromatograms of acrylamide standard(a),acrylamide isotope internal standard(b) and coffee blank matrix spike(c)

2.3 凈化方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇首先，采用正己烷將脂肪及低極性化合物除去，然后加入K4[Fe(CN)6]利于咖啡中蛋白質(zhì)的鹽析并吸附，且丙烯酰胺易溶于水，利于咖啡中丙烯酰胺的提??；另一方面，溶液中的無機(jī)鹽離子還可促進(jìn)后續(xù)的液-液萃取過程中水相與乙酸乙酯相的分層。

2.3.2 凈化填料的優(yōu)化選擇實驗中首先采用硅藻土吸附劑對提取溶液進(jìn)行凈化，吸附劑與外界提取溶液接觸后吸收水分子后被其包被和活化，而提取溶液中的低極性化合物和無機(jī)鹽離子等被其吸附，再利用乙酸乙酯與吸附劑表面的液-液萃取而將目標(biāo)化合物萃取，而GCB的加入，能夠進(jìn)一步的除去咖啡提取溶液中的色素，相對于PSA、C18、NH2和Florisil等吸附材料，GCB能夠較好的吸附色素，并且在后續(xù)的質(zhì)譜分析中能夠減小基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.3 凈化填料使用量的優(yōu)化選擇試驗了分別在100、200、300、400、500和600 mg硅藻土中加入2 mL 提取溶液時，對于丙烯酰胺的回收效果。結(jié)果表明，隨著硅藻土加入量的增加，丙烯酰胺的回收率逐漸增加，當(dāng)硅藻土加入量達(dá)到400 mg時達(dá)到最大的回收效果(76.3%)，隨后其回收降低。通過GCB不同加入量對丙烯酰胺回收效果的比較，確定當(dāng)GCB加入量為50 mg時達(dá)到了較好的回收效果(78.5%)。因此，選擇加入400 mg硅藻土和50 mg GCB吸附劑為較優(yōu)的用量。

2.4 線性范圍和檢出限

分別將丙烯酰胺用乙腈稀釋成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別加入固定含量丙烯酰胺同位素內(nèi)標(biāo)，以丙烯酰胺峰面積與丙烯酰胺同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，對各濃度進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，丙烯酰胺在0.01～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)較好(r2=0.9996)；同時選取咖啡基質(zhì)加入一定濃度的丙烯酰胺，按照上述的前處理和測定方法，以3倍和10倍信噪比(S/N)所對應(yīng)的加標(biāo)濃度得到檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.15 mg/kg。根據(jù)歐盟對于焙烤咖啡中丙烯酰胺的限量要求為0.4 mg/kg，本方法的檢出限和定量限完全能夠滿足該限量要求。

目前，國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.204-2014)的第一法中使用了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法在操作過程中將樣品提取液完全或者分取一半進(jìn)行后續(xù)的凈化過程，得到了較好的測定效果，但是該方法主要是針對常見的熱加工食品中丙烯酰胺的測定。本研究中采用分取少量提取溶液進(jìn)行后續(xù)測定，取得了較好的凈化效果和檢測靈敏度，且相對于國家標(biāo)準(zhǔn)中的操作步驟，本方法較為簡便可行。

2.5 回收率和精密度

本實驗中，選取鐵皮卡、卡杜拉和卡蒂姆等代表性咖啡樣品，分別以丙烯酰胺的定量限、5倍和10倍定量限作為添加濃度進(jìn)行回收試驗和精密度測定，每個添加濃度進(jìn)行6次平行試驗。結(jié)果如表2所示，丙烯酰胺的回收率范圍為73.6%～81.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為4.7%～6.7%。

表2 丙烯酰胺的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)

2.6 實際樣品的測定

抽取當(dāng)?shù)爻屑稗r(nóng)貿(mào)市場中的烘焙咖啡和速溶咖啡樣品各10個樣品進(jìn)行丙烯酰胺測定，測定結(jié)果為：烘焙咖啡中丙烯酰胺含量范圍為0.164～0.226 mg/kg，速溶咖啡中丙烯酰胺含量范圍為0.071～0.326 mg/kg。根據(jù)歐盟對于烘焙咖啡和速溶咖啡中丙烯酰胺的限量標(biāo)準(zhǔn)分別為0.40 mg/kg和0.85 mg/kg，此次抽樣的烘焙咖啡和速溶咖啡中的丙烯酰胺含量均未超過標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

本文利用改進(jìn)的QuEChERS方法，建立了利用親水色譜柱的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定咖啡中丙烯酰胺的方法。方法的回收率、準(zhǔn)確度和精密度均滿足咖啡中丙烯酰胺的測定和限量要求。