宋朝霞，付 佳，王 艷，黃 鋒

(河南工程學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 451191)

三苯甲烷類染料是目前常用的三大類染料之一，具有致癌、致畸、致突變的缺點[1]。該類染料具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在自然界中很難被降解，給人類健康和自然生態(tài)平衡造成了巨大的壓力。自然界中存在具有降解染料能力的微生物，如細菌、白腐真菌、放線菌和藻類等，尤其是白腐真菌具有底物廣泛性、降解效率高、能耗低、適應(yīng)性強等特點[2]，在染料廢水的處理上具有廣闊的應(yīng)用前景。在篩選得到白腐真菌的基礎(chǔ)上，本研究以三苯甲烷類染料甲基藍為處理對象，考察白腐真菌在不同溫度、pH值、染料濃度與葡萄糖濃度等條件下對甲基藍脫色率的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌源

菌種樣品取自河南工程學(xué)院校園里的自然朽木，經(jīng)分離純化后得到。

1.1.2培養(yǎng)基

愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，愈創(chuàng)木酚25 mL/L，瓊脂15 g/L，pH值為7。

PDA液體培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值。PDA固體培養(yǎng)基另加2%的瓊脂粉。

1.2 實驗方法

1.2.1菌株的分離、純化

將腐朽木段經(jīng) 75%酒精表面消毒后，取一定量朽木樣品置于滅菌生理鹽水中，搖床振蕩30 min，對懸浮液進行梯度稀釋。取稀釋液涂布于愈創(chuàng)木酚初篩培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)3 d。白腐真菌能夠在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上產(chǎn)生粉紅色透明圈，選取產(chǎn)生粉紅色透明圈的菌株繼續(xù)劃線分離直至培養(yǎng)出純菌株。將純化的菌絲轉(zhuǎn)移至PDA 斜面，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2菌株形態(tài)學(xué)鑒定

參照魏景超的《真菌鑒定手冊》[3]對菌株進行形態(tài)特征鑒定。將菌種接種至PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，觀察菌株在整個生長過程中的變化，包括菌落形態(tài)、顏色、表面狀況、邊緣是否整齊、生長速度、干燥情況、正反面差異等。

用接種環(huán)挑取少許菌絲，浸潤在含有純凈水的載玻片上，經(jīng)烘烤定型后使用亞甲基藍染液染色4 min，蓋上蓋玻片，用蒸餾水沖洗掉染液，待干后在顯微鏡下觀察。

1.2.3菌絲體的制備

將活化的菌絲體接種到PDA液體培養(yǎng)基中，控制搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，在30 ℃下持續(xù)通風(fēng)培養(yǎng)3 d左右，直至PDA液體培養(yǎng)基中長出均勻的菌球。

1.2.4甲基藍標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制質(zhì)量濃度分別為10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、70 mg/L和90 mg/L的染料標(biāo)準(zhǔn)液，使用紫外可見分光光度計在530 nm處測定該染料標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，以濃度為x軸、吸光度為y軸，繪制染料標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5脫色實驗流程

向培養(yǎng)好白腐真菌發(fā)酵液的錐形瓶中加入一定量的無菌模擬染料廢水后置于搖床中進行脫色實驗。

1.2.6染料脫色率的計算

染料脫色率計算公式為

(1)

式中：t為脫色率；A為脫色前染料的初始吸光度；Ai為脫色后染料的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株選育

經(jīng)過分離純化得到一株在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生明顯粉紅色透明圈的真菌，該菌菌落呈白色，圓形，表面呈絨毛狀，干燥，邊緣整齊，菌落不透明，菌落特征如圖1所示。對該菌株進行染色鏡檢，菌株有發(fā)達的菌絲體，有多核菌絲，有隔膜、鎖狀聯(lián)合，符合白腐真菌鏡檢特征，編號SH02，如圖2所示。

圖1 菌株SH02菌落Fig.1 Colony of the strain SH02

圖2 菌株SH02鏡檢結(jié)果Fig.2 Microscopic examination of the strain SH02

2.2 白腐真菌脫色實驗

2.2.1染料標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

甲基藍標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。由圖3可知，甲基藍標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度與甲基藍質(zhì)量濃度為0～90 mg/L時呈線性相關(guān)，線性回歸方程為y= 0.007 3x-0.012 8，R2= 0.998 9。在脫色實驗中可采用該線性回歸方程計算溶液中甲基藍的濃度。

2.2.2染料初始濃度對脫色率的影響

在pH值為7、恒溫30 ℃的條件下，考察白腐真菌在不同染料濃度下對甲基藍脫色效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖3 甲基藍標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of methyl blue

圖4 甲基藍初始濃度對菌株SH02脫色率的影響Fig.4 Effect of methyl blue concentration on the decolorization rate by SH02

由圖4可知，甲基藍初始質(zhì)量濃度為10～50 mg/L，隨著濃度的增大白腐真菌脫色率不斷增大，當(dāng)甲基藍初始質(zhì)量濃度達到50 mg /L時，脫色率為60.3%，但染料初始濃度繼續(xù)增大，脫色率急劇下降，當(dāng)染料初始質(zhì)量濃度達到70 mg/L時，脫色率僅為29.9%。分析原因可能是因為染料濃度不斷提高對菌絲體的毒性逐漸增大，導(dǎo)致白腐真菌菌絲體的生長或酶的分泌受到抑制，最終影響菌絲體對染料的脫色效果。

2.2.3初始pH值對脫色率的影響

在甲基藍初始質(zhì)量濃度為 50 mg/L、恒溫30 ℃的條件下，在pH 值為2～8時考察白腐真菌脫色效果，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，在不同pH值緩沖體系中，白腐真菌對甲基藍染料的脫色效果有明顯的區(qū)別。其中，在pH值為5～7的條件下，體系中甲基藍的脫色率相對較高，尤其是在pH值為6時，脫色效果最好，脫色率達到69.7%。當(dāng)體系pH值小于5時，脫色率隨pH值的降低而顯著降低。分析原因可能是由于pH 值的變化直接影響真菌表面所帶電荷的電性及甲基藍的電離狀態(tài)，進而影響微生物與染料分子的結(jié)合能力，最終導(dǎo)致脫色效果的差異，也可能是由于pH 值的變化對白腐真菌產(chǎn)生特定的染料降解酶有影響[4]。

2.2.4溫度對脫色率的影響

以甲基藍初始質(zhì)量濃度為 50 mg/L、pH值為6的模擬染料廢水為研究對象，考察白腐真菌在不同溫度下對甲基藍的脫色效果，結(jié)果如圖6所示。

圖5 初始pH值對菌株SH02脫色率的影響Fig.5 Effect of initial pH on the decolorization rate by SH02

圖6 不同溫度對菌株SH02脫色率的影響Fig.6 Effect of temperature on the decolorization rate by SH02

由圖6可知，當(dāng)脫色溫度為30 ℃時，白腐真菌對甲基藍的脫色效果最好，脫色率達到66.2%，一旦溫度低于30 ℃，脫色效果會變差。從圖6中還可以看出，在25～30 ℃條件下脫色率明顯高于15～20 ℃時。溫度對脫色效果的影響主要是因為溫度的變化直接影響染料降解酶的活性和穩(wěn)定性，酶在最適溫度范圍內(nèi)活性最大，酶促反應(yīng)速度最快。溫度過低，酶不能充分發(fā)揮其活性，而溫度過高，酶容易變性失活，都會導(dǎo)致酶的催化效率降低，最終影響脫色率。已有研究表明，白腐真菌的最適溫度為25～30 ℃，溫度過低，白腐真菌菌絲體生長緩慢，溫度過高則白腐真菌菌絲體易衰亡[5]。

2.2.5葡萄糖濃度對脫色率的影響

張慶云等[6]研究發(fā)現(xiàn)糖類(果糖) 作為共代謝基質(zhì)對混合菌群脫色降解活性黑5有一定的促進作用。程永前等[7]和林錦美等[4]也有研究表明，投加一定量的外加碳源-葡萄糖能提高白腐真菌的脫色能力。因此，在恒溫30 ℃、甲基藍初始質(zhì)量濃度 50 mg/L、pH值為6的條件下，考察外加碳源-葡萄糖對甲基藍脫色效果的影響，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，當(dāng)體系中不添加葡萄糖時脫色率為66.5%，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為0.2 g/L時脫色率最高，達到78.9%，之后隨著葡萄糖濃度的進一步升高，脫色效果變差。分析原因可能是在碳源相對缺乏的情況下，菌株會分泌相應(yīng)的酶類對染料進行降解，使其轉(zhuǎn)化成菌體可以利用的物質(zhì)以維持細胞生長，而在碳源相對充足的情況下，菌株優(yōu)先利用葡萄糖進行生長，染料降解酶分泌較少，不利于脫色。

2.2.6脫色機制推測

甲基藍作為一種常見的三苯甲烷類染料，具體結(jié)構(gòu)如圖8所示。其中，醌型苯環(huán)形成大的共軛體系是主要的發(fā)色團，氨基作為助色團，兩者共同反映染料顏色[8]。在脫色過程中，白腐菌SH02菌球始終呈現(xiàn)乳白色，說明微生物是依靠分泌到胞外的木質(zhì)素氧化酶系作用于發(fā)色團或助色團對染料進行脫色的。甘莉等[9]在利用菌株B.Cepacia C09G 對孔雀綠進行脫色的實驗中，也通過光譜分析說明孔雀綠的—NH2、—NH/CO等官能團被破壞。

圖7 不同葡萄糖濃度對菌株SH02脫色率的影響Fig.7 Effect of glucose concentration on the decolorization rate by SH02

圖8 甲基藍分子結(jié)構(gòu) Fig.8 Structure of the methyl blue

3 結(jié)語

從河南工程學(xué)院校園朽木上分離到一株白腐真菌，利用其對甲基藍進行脫色，通過單因素實驗，最終確定在甲基藍質(zhì)量濃度為50 mg/L、pH值為6、葡萄糖添加量為 0.2 g/L時的脫色體系，白腐真菌在30 ℃時對甲基藍的脫色效果最好，脫色率達到78.9%。