朱小華 呂列超 趙金亮 劉巧云 夏 玥 張 迪
(1.常州佳德醫(yī)藥科技有限公司,江蘇 常州 213164;2.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 常州 213164)
AL58805[1]是1類分子靶向抗腫瘤創(chuàng)新藥物,已獲得了國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒發(fā)的臨床試驗批件(批件號2017L15180 和2017L05181),目前已進入臨床研究[2]。AL58805進入人體后,會選擇特定的致癌位點來發(fā)揮作用,使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性死亡,而不會波及周圍的正常組織細(xì)胞。通過抑制腫瘤信號通路,對特定腫瘤有顯著的治療作用,為癌癥患者帶來了新的希望[3]。由于AL58805為對甲苯磺酸鹽,在合成中使用了有機溶劑甲醇和乙醇,有可能會反應(yīng)生成潛在基因毒雜質(zhì)對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯[4],因此建立對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯的測定方法很有必要。
目前,對甲苯磺酸酯類的檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6-8]、氣質(zhì)聯(lián)用法[9-10]等。高效液相色譜法具有低成本、分離效率快、靈敏度高、適用于熱不穩(wěn)定化合物等優(yōu)點。本研究建立了HPLC法測定AL58805原料藥中對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯含量的方法,可為該藥有害雜質(zhì)的檢測提供參考。
AL58805制劑臨床服藥劑量約為150 mg·d-1,根據(jù)EMA《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》規(guī)定的限度,每人不能超過1.5 μg·d-1,則得到AL58805原料藥中對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)限度均為10 ppm[11]。
Agilent1260高效液相色譜儀,配置二極管陣列檢測器。
AL58805原料藥(常州佳德醫(yī)藥科技有限公司,批號:20150501、20150601、20150701);MPTS(對甲苯磺酸甲酯,阿拉丁,含量98.0%,批號E1528080);EPTS(對甲苯磺酸乙酯,阿拉丁,含量98.0%,批號H1524007);乙腈(色譜純);磷酸(分析純);氫氧化鈉(分析純);水。
InertSustain C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm);流動相:0.015 mol·L-1磷酸水溶液-乙腈(50∶50,V/V);檢測波長為225 nm;流速為1 mL·min-1;柱溫為35 ℃;進樣量為20 μL;洗脫時間為18 min;溶劑為乙腈-水(50∶50,V/V)。
2.2.1對照品溶液的制備
精密稱取MPTS對照品適量,加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液,作為對MPTS貯備液。另精密稱取EPTS對照品適量,加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液,作為EPTS貯備液。分別精密量取MPTS、EPTS貯備液適量,加溶劑稀釋制成每1 mL中約含MPTS、EPTS各10 μg的混合溶液作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量,加溶劑稀釋制成每1 mL中約含MPTS、EPTS各100ng的混合溶液,作為對照品溶液。
2.2.2供試品溶液的制備
取AL58805原料藥約100 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加適量溶劑溶解后,用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9,加溶劑稀釋至刻度,搖勻,超聲10 min,于0℃析晶30 min后,取出強力振搖,靜置60 min后,用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
精密量取對照品貯備液20 μL注入液相色譜儀,在200~400 nm的波長范圍進行PDA掃描。結(jié)果顯示,MPTS和EPTS在225nm處有最大吸收,因此選擇225 nm作為檢測波長。
對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各取 20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果顯示,AL58805、MPTS、EPTS完全分離,保留時間分別為6.340、10.733、14.038 min,空白溶液對MPTS、EPTS的測定無干擾,說明本色譜條件專屬性良好。
精密量取新鮮制備的對照品溶液20 μL,分別于0、3、7、10、17、24 h 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果顯示,MPTS、EPTS的RSD 分別為3.8%、3.7%。結(jié)果表明,對照品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
分別精密量取MPTS、EPTS貯備液適量,采用逐步稀釋法,精密量取20 μL注入液相色譜儀,記錄信噪比(S/N)約為10和3時的色譜圖。測得MPTS、EPTS的定量限(S/N≈10)分別為9.960、13.64 ng·mL-1,檢測限(S/N≈3)分別為3.320、4.550 ng·mL-1。
精密量取MPTS貯備液適量,加溶劑稀釋制成濃度分別為3.320、30、60、100、150、200 ng·mL-1的線性系列溶液;另精密量取EPTS貯備液適量,加溶劑稀釋制成濃度分別為4.550、30、60、100、150、200 ng·mL-1的線性系列溶液;分別精密量取 20 μL注入液相色譜儀,記錄MPTS、EPTS的峰面積。以濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)X,峰面積為縱坐標(biāo)Y,進行線性回歸。求得回歸方程分別為MPTS:Y=0.0638X+0.0029,R2=0.9997;EPTS:Y=0.0623X+0.0456,R2=0.9992。線性范圍分別為EPTS:3.320~200 ng·mL-1;MPTS:4.550~200 ng·mL-1。
3.6.1重復(fù)性
精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液0.10 mL,置10 mL量瓶中,共量取6份,加入已知MPTS、EPTS含量的待測原料藥AL58805約100 mg,加適量溶劑溶解,按“2.2.2”項下處理,取續(xù)濾液作為重復(fù)性試驗溶液。分別精密量取20 μL注入液相色譜儀,記錄MPTS、EPTS的峰面積。結(jié)果表明,MPTS、EPTS的回收率分別為105.8%、99.0%,RSD分別為1.2%、2.3%。
3.6.2中間精密度
更換儀器和日期,按“3.6.1”項下重新配制6份試樣溶液進行檢測。中間精密度與重復(fù)性試驗12次結(jié)果表明,MPTS、EPTS的回收率分別為106.5%、92.5%,RSD分別為1.2%、7.6%。結(jié)果表明,該方法具有良好的精密度。
分別取已知MPTS、EPTS含量的原料藥AL58805約100 mg,置10 mL量瓶中,依次加入“2.2.1”項下對照品貯備液0.07,0.10,0.13 mL各3份,加適量溶劑溶解,按“2.2.2”項下處理,制成低、中、高濃度的回收率溶液。精密量取各回收率試驗溶液和對照品溶液各20 μL,注入液相色譜儀,記錄MPTS、EPTS的峰面積。計算MPTS、EPTS在供試品中的回收率分別為92.1% 、101.4%,RSD均為2.8%。結(jié)果見表1、表2。
采用了“2.1”項下的方法,適量調(diào)整了色譜條件參數(shù)(柱溫、流速、色譜柱品牌),精密量取供試品溶液和對照品溶液各20 μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果表明,本法具有良好的耐用性。
表1 回收率試驗結(jié)果(MPTS,n=9)
表2 回收率試驗結(jié)果(EPTS,n=9)
取AL58805原料藥,按“2.2”項下方法制備供試品溶液和對照品溶液,按“2.1”項下色譜條件,分別精密量取供試品溶液和對照品溶液各20μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算AL58805原料藥中MPTS、EPTS的含量。結(jié)果顯示,三批供試品中均未檢出MPTS、EPTS,圖譜見圖1。
A:對照品溶液,B:供試品溶液圖1 典型色譜圖Fig. 1 TypicalChromatograms
由于本方法中供試品濃度較高,故增加了樣品前處理步驟(溶解、析晶、過濾等),從而大大降低了進樣溶液中供試品濃度,減少高濃度樣品溶液對雜質(zhì)測定的干擾。
綜上所述,本文建立的采用HPLC法測定原料藥AL58805中基因毒雜質(zhì)對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯,方法具有成本低廉、靈敏度高,操作簡單等優(yōu)點,可以為原料藥AL58805的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。