劉佳寧，馬銀鵬，張丕奇，馬慶芳

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010)

0 引 言

黑木耳(Auriculariaheimuer)[1]是中國珍貴的食藥兼用真菌[2]。目前，黑木耳已成為我國栽培產(chǎn)量僅次于香菇的第二大食用菌品種[3]。

近年來，隨著我國食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷壯大和高速發(fā)展，黑木耳的栽培模式也從單門獨戶的小作坊式生產(chǎn)逐漸發(fā)展到工廠化生產(chǎn)，我國各地的菌包生產(chǎn)企業(yè)從無到有逐漸發(fā)展壯大。工廠化生產(chǎn)出的黑木耳菌包具有生產(chǎn)速度快，大小、質(zhì)量規(guī)格統(tǒng)一，菌絲培養(yǎng)條件和時間相近，出耳芽較齊整的特點。由于工廠內(nèi)存在大量的木屑、麥麩等原材料，生產(chǎn)環(huán)節(jié)和環(huán)境條件又極利于雜菌生長，因此黑木耳菌包生產(chǎn)廠的病害防治工作就顯得極為重要，一旦爆發(fā)大規(guī)模病害將造成不可估量的損失。本研究從龍江縣及其周邊的多個黑木耳菌包生產(chǎn)廠采集病原菌樣品，根據(jù)科赫法則的基本步驟進(jìn)行了一系列分離培養(yǎng)、病原菌回接和形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定等試驗，確定了該病原菌的分類地位，為后續(xù)防治工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與病原菌菌株獲取

采集具有典型病害特征的樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲取純病原菌菌株。該病害的典型特征為：病原菌在黑木耳菌袋內(nèi)生長，萌發(fā)初期菌絲為白色或淡黃色，3～4 d后病原菌的菌落呈淡黃色或黃色。隨著病原菌菌落的不斷生長，菌落邊緣的菌絲快速生長，初期呈白色后期呈淡黃色，當(dāng)病原菌全部長滿菌袋時，菌袋呈黃色。這種病害發(fā)生以后，剖開被感染的菌袋可發(fā)現(xiàn)，黑木耳菌絲生長緩慢，菌袋內(nèi)的培養(yǎng)基幾乎都被病原菌占據(jù)，造成黑木耳菌絲沒有可利用的培養(yǎng)基而無法生長，如圖1所示。

1.2 實驗室復(fù)制病害典型特征

在黑龍江省龍江縣黑木耳菌袋生產(chǎn)廠場采集具有明顯病癥的標(biāo)本，經(jīng)分離純化后獲得純菌落，命名為未知病原菌(Unknown pathogen)。

根據(jù)科赫式法則，將分離出的病原菌與黑木耳進(jìn)行回接試驗(試驗所用木耳菌為 “黑威29”，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所提供)，定期觀察，記錄發(fā)病情況。經(jīng)過2周的培養(yǎng)后，黑木耳菌袋內(nèi)出現(xiàn)了與病原地所采集樣品同樣的發(fā)病特征。

1.3 培養(yǎng)基配方

其一，改良PDA培養(yǎng)基。配方為：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g。

其二，菌袋培養(yǎng)基配方：木屑78%、麥麩20%、石膏1%、石灰1%。

其三，查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(CYA培養(yǎng)基)配方：酵母粉5.0 g、蔗糖 30.0 g、NaNO33.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5g、MgSO47H2O 0.5 g、FeSO47H2O 0.01 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水 1.0 L。

圖1 不同生長時期的黑木耳病原菌菌袋Fig.1 Bags of pathogens of Auricularia auricula at different growth stages

1.4 形態(tài)鑒定

用接種針將菌袋內(nèi)的病原菌菌絲挑入改良PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，獲得純菌落。間隔24 h測量菌落直徑，觀察外觀形態(tài)變化及顏色等，直至菌落長滿平板為止，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。用接種針挑取適量培養(yǎng)基、菌絲及其產(chǎn)物，置于載玻片的無菌水中，蓋好蓋玻片后直接在顯微鏡下觀察照相并測量。

1.5 菌絲體培養(yǎng)及DNA提取

將菌種活化后接種于液體PD培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)3～5 d，收集菌絲，濾紙吸干后置于-20℃保存。采用CTAB 法提取DNA。DNA 提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

1.6 ITS序列比對與分析

對未知病原菌(unknown pathogen)，進(jìn)行ITS 序列的擴(kuò)增，引物為ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′、ITS4-：5′-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3′。引物由大連寶生物有限公司合成。PCR反應(yīng)在Gene Amp PCR System 9700 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，20 μL的反應(yīng)體系內(nèi)各種成分反應(yīng)體系見表1，擴(kuò)增程序見表2。測序由上海生物工程有限公司完成。

表1 ITS序列擴(kuò)增反應(yīng)體系表Tab.1 ITS sequence amplification reaction system

表2 擴(kuò)增程序設(shè)置表Tab.2 Amplification program setting

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

PDA培養(yǎng)基上生長迅速，25℃培養(yǎng)5 d菌落直徑6.9～7.2 cm，菌絲白色，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)灰綠色，反面無色，無滲出液產(chǎn)生，無可溶性色素產(chǎn)生。菌絲細(xì)，具隔，分生孢子梗頂端輪軸狀分狀，排列不規(guī)則，小梗稍膨大，分生孢子串生，橢圓形。

CYA培養(yǎng)基，25℃，培養(yǎng)7 d，菌落直徑約5.6～6.8 cm，白色或中心帶有暗黃色，短絲絨狀，致密，扁平，薄，中心有短放射狀褶皺，無滲出液，無可溶性色素，反面淡黃色。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)掃帚狀，分生孢子梗分枝較短。孢子囊在短分支頂部長出小梗，小梗彎曲，頂部細(xì)尖。分生孢子多數(shù)亞圓形和橢圓形，少數(shù)瓜子形，表面光滑。

圖2 未知病原菌菌落在CYA培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.2 Morphology of unknown pathogen colonies on CYA medium

2.2 序列分析

2.2.1 ITS擴(kuò)增結(jié)果及分析

測序結(jié)果顯示，供試菌株ITS 序列為506 bp，如下：

菌株的ITS 序列已提交GenBank，接受號為HM383041。

2.2.2 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

用已經(jīng)獲得的未知病原菌ITS序列在GenBank中比對，與相似度最高的6個不同種建立進(jìn)化樹，6種序列名稱及GenBank號見表3：

表3 相似度較高的7個種的ITS 序列名稱及號碼表Tab.3 Seven kinds of ITS sequence names and numbers with high similarity

圖3 未知病原菌(unknown pathogen)與相似度較高的6個品種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic trees of unknown pathogens and 6 varieties with high similarity

由圖3可知，各分枝內(nèi)菌株間的最大遺傳距離較大。其中病原菌(unknown fungi)與已知種Byssochlamysspectabilis，GenBank編號KT824760.1的序列遺傳距離差異為0.0000，經(jīng)比對后，其相似度為99%。結(jié)合宏觀經(jīng)典分類學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步確定，該病原菌為壯觀絲衣霉(Byssochlamysspectabilis)。其生物學(xué)分類為：子囊菌門(Ascomycota)、不整囊菌綱(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、曲霉科(Aspergillaceae)、絲衣霉屬(Byssochlamys)、壯觀絲衣霉(Spectabilis)。

3 討論

根據(jù)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法鑒定，將病原菌確定為壯觀絲衣霉，該真菌屬于散囊菌目(又稱曲霉目或不整囊菌目)。在散囊菌目中，青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬內(nèi)的多種真菌廣泛存在于土壤空氣和水等自然環(huán)境中，這些真菌在獲得適合的生長條件下往往可以高速生長、繁殖。在為生產(chǎn)黑木耳的菌包中存在大量的營養(yǎng)，可以被這些真菌利用。菌包生產(chǎn)企業(yè)如果未能在滅菌、接菌或培養(yǎng)等環(huán)節(jié)嚴(yán)格杜絕病原菌入侵，將會為病原菌的集中爆發(fā)提供有利條件，且在下一階段的栽培環(huán)節(jié)中，在高溫、高濕且栽培大棚通風(fēng)較差的情況下，病原菌也極易生長，造成病害的大規(guī)模發(fā)生。由于黑木耳本身的生長、生殖所需要的營養(yǎng)、溫度、濕度、pH、水分等基礎(chǔ)條件與病原菌所需條件有巨大的交集，該病原菌由于生長速度極快，與黑木耳形成競爭關(guān)系，兩種真菌共同利用培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，因此對該病害的防治造成較大困難，希望通過后續(xù)研究能夠找到應(yīng)對該病害的合理措施。