錢(qián) 青 高春巖 申宇鴻 宋世珅 郭乃洲 高 雯

1北京市和平里醫(yī)院，北京，100013；2鹽城市第一人民醫(yī)院，鹽城，224000

尋常型銀屑病的免疫機(jī)制是過(guò)度增生的角質(zhì)形成細(xì)胞、炎性樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞之間相互作用，Th17與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)失衡，導(dǎo)致皮膚慢性紅斑、鱗屑樣炎癥性病變[1]。在Th17/Treg細(xì)胞分化過(guò)程中，樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)作為一種重要的抗原提呈細(xì)胞發(fā)揮重要的作用。DCs細(xì)胞表面整合素相關(guān)蛋白(integrin-associated protein，IAP或CD47)與其配體血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin-1, TSP-1)結(jié)合可抑制DCs分化成熟，降低炎性細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)Treg分化，抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)[2,3]。但尋常型銀屑病患者外周血髓系樹(shù)突狀細(xì)胞(myeloid DCs, mDCs)CD47表達(dá)水平及其功能缺乏研究，本次研究通過(guò)檢測(cè)銀屑病患者外周血mDCs表面CD47表達(dá)水平，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，用CD47配體TSP-1結(jié)合單核細(xì)胞誘導(dǎo)形成的mDCs，分析其調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞分化的能力，探討其在銀屑病疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2018年4月至2019年6月于我院皮膚科門(mén)診就診的尋常型銀屑病患者46例，其中男24例，女22例，年齡20～58(36.2±11.4)歲，均為進(jìn)行期患者。銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類(lèi)參照《中國(guó)銀屑病治療指南(2008版)》[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：2個(gè)月內(nèi)服用免疫抑制劑、維A酸制劑，系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療；伴有關(guān)節(jié)炎、天皰瘡、皮肌炎等自身免疫性疾病；感染或其他炎癥疾病。健康對(duì)照者為本院健康體檢人群，均無(wú)炎癥性和自身免疫性疾病，其中男24例，女22例，年齡22～56(37.1±10.8)歲，兩組性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本次研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者知情同意。

1.2 儀器和試劑 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)畵P(yáng)生物公司，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)均購(gòu)自Peprotech公司。異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人Lin-1單克隆抗體(mAb)購(gòu)自BD公司、別藻青蛋白(APC)-鼠抗人CD11c mAb和葉綠素蛋白(PerCP)-cy5.5鼠抗人HLA-DR均購(gòu)自Biolegend公司。CD47采用藻紅蛋白(PE)-鼠抗人mAb。美國(guó)BD Canto II流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)mDCs細(xì)胞表面CD47平均熒光強(qiáng)度(MFI)，作為CD47表達(dá)水平。CD4+T細(xì)胞陰性分選磁珠購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司。hTSP-1購(gòu)自Abcam公司。anti-CD3購(gòu)自BD Biosciences公司。APC-鼠抗人CD25、FITC-鼠抗人CD4和PE-鼠抗人FoxP3均購(gòu)自BD公司。白細(xì)胞介素(IL)-23、IL-17和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor, TNF-α)檢測(cè)試劑購(gòu)自Bio-rad公司。CD47過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由上海漢恒生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 患者抽血前評(píng)估銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)，得分為5.8～20.2(14.2±4.8)。銀屑病患者和健康志愿者在空腹條件下采集肘部靜脈血20 mL，肝素鈉抗凝，其中0.5 mL用于流式細(xì)胞檢測(cè)mDCs CD47表達(dá)，其余用于分離單核細(xì)胞，誘導(dǎo)成mDCs。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mDCs細(xì)胞CD47表達(dá)水平 取100 μL肝素抗凝靜脈血，加入10 μL FITC-鼠抗人Lin-1mAb、10 μL APC-鼠抗人CD11c mAb、PerCP-cy5.5鼠抗人HLA-DR mAb和10 μL PE-鼠抗人CD47 mAb，室溫避光孵育30 min，然后用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗滌，并用400 μL PBS緩沖液重懸，mDCs定義為HLA-DR+Lin-1-CD11c+細(xì)胞。流式分析儀檢測(cè)以HLA-DR+Lin-細(xì)胞設(shè)門(mén)，檢測(cè)HLA-DR+Lin-CD11c+細(xì)胞表面CD47 平均熒光強(qiáng)度。

1.3.3 單核細(xì)胞誘導(dǎo)mDCs 取受試者肝素鈉抗凝血19 mL，經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離制備單個(gè)核細(xì)胞，貼壁法分離單核細(xì)胞，細(xì)胞濃度用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整為5×106/L，置6孔培養(yǎng)板，37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入500 U/mL rhGM-CSF和10 ng/mL rhIL-4，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化，隔二日半量換液，6天后收集懸浮的細(xì)胞，即誘導(dǎo)的mDCs。分兩份，其中一份經(jīng)pYr-ads-4-hCD47質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，上調(diào)CD47表達(dá)。

1.3.4 重組質(zhì)粒上調(diào)銀屑病患者mDCs CD47表達(dá) 用RPMI 1640培養(yǎng)液將3 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體和2 μg pYr-ads-4-hCD47質(zhì)粒分別稀釋至200 μL，然后將兩者混勻，混合物在室溫條件下孵育20 min，形成質(zhì)粒轉(zhuǎn)染應(yīng)用液。上述誘導(dǎo)的mDC，用RPMI 1640培養(yǎng)液將濃度調(diào)到4×105/mL，體積為200 μL，然后加入質(zhì)粒轉(zhuǎn)染應(yīng)用液200 μL，置于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h，更換為含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染效果用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD47表達(dá)水平。

1.3.5 CD4+T細(xì)胞制備 留取健康孕婦足月分娩的臍帶血，通過(guò)密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，然后使用CD4+分選磁珠分離CD4+T細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)分離提純的細(xì)胞，CD4+細(xì)胞純度大于95%。

1.3.6 mDCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng) 取上述誘導(dǎo)的健康對(duì)照者mDCs、銀屑病患者mDCs和過(guò)表達(dá)CD47的銀屑病患者mDCs，與CD4+T細(xì)胞在24孔板以1∶10比例共培養(yǎng)，反應(yīng)體系中加入5 μg/mL TSP-1和1 μg/mL anti-CD3，在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例；收集上清液，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-23、TNF-α濃度。

1.3.7 CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞檢測(cè) 收集100 μL共培養(yǎng)細(xì)胞，加入10 μL APC-鼠抗人CD25和10 μL FITC-鼠抗人CD4，避光孵育20 min。反應(yīng)體系中加入250 μL Fix/Perm緩沖液，孵育40min，經(jīng)300 μL Perm/wash緩沖液洗滌，并用100 μL Perm/wash重懸細(xì)胞。加10 μL PE-鼠抗人FoxP3，避光孵育30min。PBS洗滌后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀以CD4+CD25+細(xì)胞設(shè)門(mén)，檢測(cè)CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例。

1.3.8 Luminex檢測(cè)細(xì)胞因子濃度 收集共培養(yǎng)上清液，按試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-23和TNF-α濃度，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)兩次，取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)經(jīng)Stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料均為正態(tài)性分布，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)students’ t-test作雙側(cè)檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血mDCs表面CD47表達(dá)水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血mDCs表面CD47表達(dá)水平(圖1)，與健康對(duì)照組相比，銀屑病患者外周血mDCs細(xì)胞CD47表達(dá)水平顯著降低(32.8±10.3 vs 63.6±12.5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.2,P<0.001)。見(jiàn)圖2。

2.2 銀屑病患者外周血mDCs CD47表達(dá)水平與PASI相關(guān)性分析 銀屑病患者外周血mDCs細(xì)胞CD47表達(dá)水平與PASI負(fù)相關(guān)(r=-0.651,P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.3 誘導(dǎo)的mDCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子檢測(cè) 與健康對(duì)照組相比，銀屑病患者組單核細(xì)胞誘導(dǎo)的mDCs細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-23、TNF-α濃度顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.4 誘導(dǎo)的mDCs與CD4+細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)Treg分化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例(圖5)，與健康對(duì)照組相比(n=46)，銀屑病患者單核細(xì)胞誘導(dǎo)的mDCs細(xì)胞(n=46)和CD4+淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞比例顯著降低(3.8±1.4% vs 6.2±2.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.5,P<0.001)。

1a：HLA-DR+Lin-細(xì)胞；1b：HLA-DR+Lin-CD11c+細(xì)胞；1c：mDCs CD47 MFI圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血mDCs表面CD47表達(dá)水平

圖2 外周血mDCs表面CD47 MFI比較 圖3 銀屑病患者mDCs CD47 MFI與PASI相關(guān)性分析 圖4 共培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子濃度 (pg/mL)

注：*P<0.05 銀屑病未轉(zhuǎn)染CD47組vs銀屑病轉(zhuǎn)染CD47組

2.5 重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá)CD47的mDCs細(xì)胞與CD4+細(xì)胞共培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染人CD47重組質(zhì)粒上調(diào)銀屑病患者mDCs細(xì)胞CD47表達(dá)。與銀屑病未轉(zhuǎn)染組相比，銀屑病轉(zhuǎn)染CD47組mDCs細(xì)胞與CD4+細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-23和IL-17濃度顯著降低，誘導(dǎo)CD4+Treg分化顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

在銀屑病的疾病過(guò)程中，DCs異?；罨倾y屑病發(fā)病機(jī)制中的上游環(huán)節(jié)[5]，在銀屑病患者的皮損真皮層中，浸潤(rùn)的炎性CD11c+髓系DC數(shù)量與正常皮膚相比顯著增加，并異?；罨置诖罅空T導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α和IL-23等炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1、Th17細(xì)胞擴(kuò)增，是銀屑病發(fā)病的重要因素[6]。mDCs細(xì)胞由單核細(xì)胞分化而來(lái)，在疾病狀態(tài)角質(zhì)形成細(xì)胞通過(guò)分泌趨化因子CCL20募集大量CCR6+的mDCs到病損部位，維持炎癥反應(yīng)[7]。在小鼠銀屑病模型中，通過(guò)使用中和抗體去除mDCs的前體即單核細(xì)胞，小鼠疾病嚴(yán)重程度顯著降低，表明mDCs在維持銀屑病癥狀發(fā)揮重要作用[8]。

CD47分子是一種分布于細(xì)胞表面的信號(hào)受體，與TSP-1結(jié)合可抑制DCs細(xì)胞成熟和分泌炎癥細(xì)胞因子，降低機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)損傷的應(yīng)答[9]。動(dòng)物模型證實(shí)，CD47缺陷小鼠經(jīng)免疫致敏物質(zhì)刺激后，誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于野生型小鼠，機(jī)制是DCs細(xì)胞CD47信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制T細(xì)胞的激活，從而降低炎癥反應(yīng)[10]。本次研究表明，銀屑病患者外周血mDCs表面CD47表達(dá)顯著降低，且和疾病嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)。Rodríguez-Jiménez等[11]證實(shí)銀屑病患者外周血CD4+細(xì)胞CD47 mRNA和mDC CD47表達(dá)降低，單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)形成的mDCs細(xì)胞TSP-1 mRNA表達(dá)降低。上述研究均表明，銀屑病患者mDCs細(xì)胞CD47信號(hào)通路表達(dá)降低。

銀屑病mDCs主要通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α和IL-23參與銀屑病炎癥。與健康人群相比，銀屑病患者的病變皮膚和血清中均檢測(cè)到TNF-α水平升高。TNF-α是IL-23/IL-17信號(hào)途徑的上游細(xì)胞因子[1]，可與IL-17等細(xì)胞因子協(xié)同作用而增強(qiáng)促炎活性，使用TNF-α阻斷劑可改善銀屑病患者臨床癥狀，并減少病損組織的IL-17濃度[12]。此外，阻斷IL-23也可產(chǎn)生非常有效的臨床結(jié)果，證明IL-23是銀屑病的關(guān)鍵細(xì)胞因子[13]。本次研究證實(shí)，銀屑病患者單核細(xì)胞誘導(dǎo)的mDCs分泌高濃度的IL-23和TNF-α。

mDCs產(chǎn)生的IL-23聯(lián)合IL-1β可誘導(dǎo)CD4+幼稚細(xì)胞向Th17分化，向Treg細(xì)胞分化降低[14]。Treg細(xì)胞是機(jī)體抑制炎癥反應(yīng)、維持自身免疫耐受的重要免疫細(xì)胞。臨床研究證實(shí)，銀屑病患者血液中IL-23濃度增加，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，抑制Treg細(xì)胞分化[15]，導(dǎo)致銀屑病患者外周血和皮膚中Treg細(xì)胞均降低[16,17]。本次研究表明，銀屑病患者單核細(xì)胞誘導(dǎo)的mDCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞比例顯著低于健康對(duì)照組。重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá)銀屑病患者mDCs細(xì)胞CD47，誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞顯著升高，分泌IL-23和IL-17顯著降低。上述研究表明，銀屑病患者mDCs CD47表達(dá)降低與其分泌促炎細(xì)胞因子升高有關(guān)，通過(guò)上調(diào)CD47表達(dá)可抑制此病理過(guò)程。

綜上所述，本次研究表明銀屑病患者外周血mDCs細(xì)胞CD47表達(dá)顯著降低，并與PASI負(fù)相關(guān)。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，銀屑病患者外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的mDCs分泌高濃度的炎性細(xì)胞因子IL-23和TNF-α，誘導(dǎo)CD4+Treg分化的功能顯著降低，通過(guò)重組質(zhì)粒上調(diào)mDCs細(xì)胞CD47表達(dá)可阻斷此作用。因此，mDCs細(xì)胞CD47低表達(dá)可能在銀屑病患者疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控mDCs細(xì)胞CD47信號(hào)通路可能是尋常型銀屑病治療的新途徑。