譚自敏 楊成蓮 鐘桂書 曾凡才

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,四川瀘州，646000;2綿陽市第三人民醫(yī)院皮膚科，四川綿陽，621000；3西南醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室,四川瀘州，646000

眾所周知，惡性黑素瘤是起源于黑素細胞的腫瘤，好發(fā)于皮膚，因其早期隱匿、病情進展快和致死率高等特點，又有人稱其為“皮膚癌中之王”，晚期惡性黑素瘤的有效治療仍是亟待解決的世界難題[1]。Nodal作為調(diào)節(jié)干細胞多潛能性、維持胚層發(fā)育和建立體軸等胚胎發(fā)育過程的關(guān)鍵因子，備受各個領(lǐng)域重視[2]。對比胚胎發(fā)育和癌癥發(fā)生發(fā)展，不難發(fā)現(xiàn)兩者在諸多方面具有相似性[3]。這也為通過靶向抑制Nodal來治療惡性腫瘤的新思路提供了理論基礎(chǔ)。Nodal的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由位于細胞膜上的II型受體(ActR II)和I型受體(ALKs)介導(dǎo)，此后依次磷酸化胞內(nèi)SMADs并調(diào)控相關(guān)靶基因表達。SB-431542是I型膜受體ALK5、ALK4和ALK7的有效抑制劑，它通過抑制ALK5/4/7阻斷Nodal信號進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)的同時也阻斷Nodal對自身的正反饋表達，起到“Nodal抑制劑”的作用。近年來，不斷有研究表明Nodal能誘導(dǎo)細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。EMT過程中，細胞內(nèi)許多分子如E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白的表達明顯改變。這些明顯變化的EMT標(biāo)志物與細胞的形態(tài)、黏附力和運動能力緊密相關(guān)。因此這些分子也常被用于反映惡性腫瘤的遷移及侵襲能力。除此之外，惡性腫瘤的發(fā)展過程和其特有的微環(huán)境也密切相關(guān)。由于惡性黑素瘤體積增大速度快、局部血管生成相對減少等原因，它區(qū)別于正常組織的微環(huán)境特點之一便是低氧[3]。因此，本實驗通過CoCl2體外造模和相關(guān)技術(shù)檢測手段，旨在研究惡性黑素瘤A375細胞內(nèi)低氧微環(huán)境對Nodal和腫瘤遷移及侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人惡性黑素瘤A375 細胞來源于中國科學(xué)院細胞庫(上海)。CoCl2·6H2O、 SB-431542購買于Sigma公司(美國)。主要材料包括一抗人抗鼠Nodal抗體(美國Santa Cruz)、人抗鼠Vimentin抗體(美國Santa Cruz)、人抗鼠MMP2抗體(美國Santa Cruz)、人抗兔E-cadherin抗體(美國Santa Cruz)、人抗兔ALK4抗體(英國 Abcam)和人抗鼠ALK7抗體(英國 Abcam)。二抗主要包括HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(美國 Bioworld)和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(美國 Bioworld)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取出前期凍存的惡性黑素瘤A375細胞，快速復(fù)蘇細胞后，于培養(yǎng)瓶中加入新鮮配置的含10% FBS的完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶放置于37℃、含5% CO2的恒溫細胞孵育箱中培養(yǎng)。間隔一日更換一次培養(yǎng)液。顯微鏡下觀察細胞均勻鋪滿瓶壁約80%后，加入0.25%的胰蛋白酶消化并以3000 r/min的速度在4℃下完成離心，視細胞狀態(tài)以1∶3或1∶2傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)細胞內(nèi)低氧 本課題組前期實驗已找到CoCl2誘導(dǎo)低氧所需的最佳時間及濃度，并成功構(gòu)建低氧模型[4]。本實驗將采取前期結(jié)論所得，即在孵育時間為48 h，濃度為150 μmol/L條件下進行后續(xù)實驗。

1.2.3 SB-431542阻斷Nodal信號通路 A375細胞培養(yǎng)至第3～8代對數(shù)生長期時進行SB-431542干預(yù)處理。將SB-431542母液用5%的FBS溶液分別稀釋至濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L。將細胞懸浮后以每孔約5×103個接種于96孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12 h至細胞貼壁。分組加入配置好的SB-431542溶液，每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)在37℃、5% CO2的細胞孵育箱中24 h、48 h和72 h。采用MTT法探索SB-431542對細胞增殖的影響并確定后續(xù)實驗所需的適宜濃度和時間。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖活力 按實驗步驟分濃度、分時間進行SB-431542阻斷后，在避光條件下于每孔內(nèi)加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)細胞4 h。吸除培養(yǎng)液并加入DMSO 150 μL，震蕩10 min以充分溶解晶體。用波長為490 nm的酶聯(lián)儀測定各孔的吸光度值(OD值)。

1.2.5 Western Blot方法檢測蛋白水平 將A375細胞以約5×105個/孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)至貼壁后棄培養(yǎng)液。實驗按分組分別進行干預(yù)(表1)。藥物干預(yù)后分別提取每孔細胞的總蛋白。利用BCA法計算細胞內(nèi)所測蛋白的濃度。接下來依次進行SDS-PAGE電泳分離、目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜、室溫封閉1 h(5%脫脂牛奶)處理。加入目標(biāo)蛋白一抗并于4℃孵育過夜。次日洗膜后用所測蛋白二抗于25℃下孵育1.5 h。最后利用ECL法顯影,利用Image Lab軟件分析。

表1 實驗分組

2 結(jié)果

2.1 Nodal抑制劑SB-431542抑制惡性黑素瘤A375細胞增殖 惡性黑素瘤A375細胞被不同濃度及不同作用時間的SB-431542孵育后，MTT法檢測結(jié)果如圖1。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相同時間下加入的Nodal抑制劑濃度越大，A375細胞的增殖活性越低。相同濃度下Nodal抑制劑對細胞的作用也呈現(xiàn)時間依賴性。當(dāng)Nodal抑制劑SB-431542的濃度大于30 μmol/L時，其對細胞的毒性作用顯著增大，細胞增殖活性顯著降低。許多涉及SB-431542處理的文獻顯示，將其濃度稀釋至10 μmol/L并再繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h，此時測得的增殖活性較低，但毒性作用不顯著。這與本實驗研究結(jié)果一致，故后續(xù)實驗Nodal抑制劑選擇此濃度和時間。

2.2 低氧誘導(dǎo)細胞內(nèi)Nodal、ALK4和ALK7蛋白表達 構(gòu)建細胞內(nèi)低氧微環(huán)境模型并加入Nodal抑制劑處理后，分別檢測各實驗組惡性黑素瘤A375細胞內(nèi)Nodal和ALK4/7的濃度。結(jié)果如圖2所示。CoCl2組細胞內(nèi)Nodal和ALK7蛋白的濃度較空白組增加，而CoCl2+SB-431542組蛋白的表達較CoCl2組明顯下降。在本研究的A375細胞株中，多次重復(fù)實驗均沒有檢測到ALK4的存在。

2.3 低氧誘導(dǎo)E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表達 利用免疫印跡法檢測與惡性黑色瘤A375細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達，檢測結(jié)果如下圖3所示。CoCl2組細胞內(nèi)MMP2和Vimentin蛋白濃度較空白組增加(P<0.05)。CoCl2+SB-431542組細胞內(nèi)的蛋白濃度仍高于空白對照組，但低于CoCl2組。本研究小組多次重復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)A375細胞內(nèi)E-cadherin蛋白的各組組間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

(**P<0.01)

2a:A375細胞經(jīng)或不經(jīng)SB-431542和(或)CoCl2干預(yù)后用western blot檢測Nodal及其受體ALK4/7的條帶顯示;2b：以β-actin為內(nèi)參，Nodal在各組中的相對表達水平;2c：以β-actin為內(nèi)參，ALK7蛋白在各組中的相對表達水平。2b、2c與空白對照組相比，**P<0.01圖2 各處理組Nodal及其受體ALK4/7蛋白的表達水平

3a:A375細胞經(jīng)或不經(jīng)SB-431542和(或)CoCl2干預(yù)后用western blot檢測與遷移及侵襲相關(guān)蛋白的條帶顯示;3b：以β-actin為內(nèi)參，MMP2蛋白在各組中的相對表達水平;3c：以β-actin為內(nèi)參，Vimentin蛋白在各組中的相對表達水平。3b、3c中與空白對照組相比，**P<0.01圖3 各處理組MMP2、Vimentin、E-cadherin的表達水平

3 討論

惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展過程中的信號級聯(lián)體系錯綜復(fù)雜，目前機制尚不完全清楚。鑒于胚胎發(fā)育過程與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的相似性，惡性腫瘤研究也越來越多地同胚胎發(fā)育聯(lián)系在一起。Nodal通過誘導(dǎo)干細胞分化、參與原始胚層形成等途徑促進胚胎發(fā)育已經(jīng)得到證實，故此猜測Nodal也可能是治療惡性腫瘤的潛在靶點[6]。Nodal在個體胚胎時期呈現(xiàn)顯著高表達狀態(tài)，隨著各個系統(tǒng)逐漸形成和完善，大多數(shù)組織和器官的表達逐漸減少直至關(guān)閉[7]。根據(jù)國內(nèi)外多項在常氧條件下進行的研究結(jié)果表明，Nodal在惡性黑素瘤細胞中已關(guān)閉的表達通道再次開啟，并被證實其表達程度隨著腫瘤細胞增殖和侵襲能力的增加而增加[8]。惡性黑素瘤的分化程度極低，較之其他高分化癌癥，其更容易處于低氧狀態(tài)。因此，在模擬體內(nèi)的低氧微環(huán)境下研究Nodal對惡性黑素瘤細胞遷移及侵襲的影響更加準(zhǔn)確客觀。

本實驗小組延續(xù)前期實驗中成功構(gòu)建的低氧模型，通過免疫印跡法檢測細胞內(nèi)Nodal及其受體的濃度。遺憾的是，各實驗組通過免疫印跡法沒有檢測到ALK4蛋白，猜測可能與細胞內(nèi)ALK4濃度低有關(guān)。我們后續(xù)將設(shè)置不同的實驗方案探索原因。與既往研究結(jié)果相比，本實驗不但同樣發(fā)現(xiàn)Nodal在惡性黑素瘤A375細胞中呈現(xiàn)再次高表達狀態(tài)，同時也證實低氧環(huán)境能誘導(dǎo)Nodal進一步表達?；诖送茰y在人體內(nèi)，由腫瘤細胞高代謝等原因引起的低氧可能會增加Nodal的表達。

為探討Nodal在腫瘤進展中可能的機制，接下來利用免疫印跡法檢測與惡性腫瘤遷移及侵襲相關(guān)蛋白的濃度。結(jié)果顯示，Nodal抑制劑SB-431542可以部分逆轉(zhuǎn)由低氧引起的胞內(nèi)MMP2的表達。MMP2是重要的降解IV型膠原蛋白的蛋白水解酶。它不僅可以通過降解細胞外基質(zhì)的方式破壞腫瘤細胞外的第一層屏障[10]，同時也可以促進新生血管生成，從而加快腫瘤發(fā)展。實驗結(jié)果表明，低氧誘導(dǎo)的Nodal高表達可能通過增加MMP2蛋白的水平來促進惡性黑素瘤細胞遷移及侵襲。

除此之外，本實驗小組還檢測了A375細胞內(nèi)Vimentin蛋白的水平變化。Vimentin蛋白對細胞形態(tài)的維持和改變?nèi)Q于其特殊構(gòu)象。當(dāng)Vimentin蛋白上游受刺激而濃度升高時，由于收縮作用增加，細胞逐漸向利于運動的梭形變化，從而加強腫瘤細胞的遷移[12]。本實驗所得Vimentin蛋白的變化趨勢與MMP2蛋白檢測結(jié)果相似。即低氧增加胞內(nèi)Nodal濃度，進而可能通過增加細胞內(nèi)Vimentin蛋白的濃度來促進惡性黑素瘤細胞的遷移及侵襲。

E-cadherin是判斷惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的有效指標(biāo)之一，其胞內(nèi)濃度可間接反映細胞間的黏附能力。當(dāng)胞內(nèi)、胞外刺激導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達受抑制時，惡性腫瘤細胞之間的黏附力隨之減弱，細胞的癌旁浸潤和遠處轉(zhuǎn)移能力隨之增強[11]。故此，我們推測低氧誘導(dǎo)下Nodal的促腫瘤機制也與E-cadherin有關(guān)。但在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，低氧及Nodal抑制劑對胞內(nèi)E-cadherin蛋白的表達差異并不顯著。究其原因，一可能是A375細胞內(nèi)E-cadherin蛋白的表達主要受其他途徑調(diào)控；二可能是惡性黑素瘤的分化程度低，其在A375細胞內(nèi)的濃度不高，上游的表達變化并不足以引起顯著改變。

綜上所述，低氧誘導(dǎo)Nodal高表達可能通過上調(diào)MMP2和Vimentin蛋白水平，從而促進惡性黑素瘤細胞的遷移及侵襲。我們下一步將繼續(xù)進行劃痕試驗和基因水平驗證低氧誘導(dǎo)Nodal高表達對A375細胞遷移及侵襲能力的影響。本實驗通過模擬低氧微環(huán)境，初步探索了Nodal在惡性黑素瘤的遷移及侵襲過程中可能的作用途徑，在探索腫瘤進展的生物學(xué)標(biāo)志物以及腫瘤治療靶點有一定的意義。