朱 彤 李連永 劉天婧 趙 群

代謝性骨病(metabolic bone disease，MBD)是指先天性或后天性的骨量減少，其生化改變特征主要為類骨質(zhì)組織和骨礦物質(zhì)成分的減少以及磷鈣代謝異常，好發(fā)于早產(chǎn)兒。該病可能受多種營養(yǎng)和生物力學(xué)因素的影響(如長期營養(yǎng)缺乏、制動和腸外營養(yǎng)以及骨代謝拮抗藥物的攝入等)[1-3]。人們通常用代謝性骨病、佝僂病或早產(chǎn)兒骨量減少來描述早產(chǎn)兒骨密度低的情況，并通過生化結(jié)果(低磷血癥、高磷血癥、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進和(或)佝僂病)和影像學(xué)證據(jù)(脆性骨折)支持診斷[3,4]。隨著新生兒重癥監(jiān)護技術(shù)的進步和早產(chǎn)兒存活率的提高，MBD在早產(chǎn)兒中的發(fā)病率越來越高。盡管人們普遍認(rèn)識到這一問題，但對該病的診斷、護理和治療尚無統(tǒng)一的認(rèn)識[5]。因此，如何對新生兒(特別是早產(chǎn)兒)骨代謝疾病進行早期診斷和治療是亟需解決的問題。

過去人們認(rèn)為，血鈣可以在一定程度上反映骨密度，但是人體血鈣水平基本維持恒定，不會隨骨密度的變化而出現(xiàn)大幅度變化。既往，血清總堿性磷酸酶水平是檢測鈣磷代謝最常用的指標(biāo)，但也不能可靠地診斷MBD并預(yù)測其嚴(yán)重程度[6,7]。近期研究表明，一些骨代謝標(biāo)志物可作為MBD的早期診斷指標(biāo)，并可有效預(yù)測MBD的長期影響(如長期持續(xù)生長受損和骨量峰值降低)[8,9]。同時維生素D作為一種激素，也可以通過腸鈣轉(zhuǎn)運增加鈣吸收，并直接影響成骨和破骨作用。有學(xué)者認(rèn)為新生兒維生素D水平與骨密度密切相關(guān)，并能夠較好地反映骨骼的健康狀態(tài)[10]。維生素D、骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)和Ⅰ型膠原C末端肽(C-telopeptides type Ⅰ collagen,CTX)等正逐漸成為不同年齡患者檢測骨量的重要指標(biāo)。本研究以維生素D、OPG、PTH和CTX 為檢測指標(biāo)，旨在探討早產(chǎn)與維生素D 和骨代謝指標(biāo)的關(guān)系，為早產(chǎn)引起的代謝性骨病的預(yù)測和防治提供理論指導(dǎo)。

材料與方法

一、研究對象與診斷標(biāo)準(zhǔn)

選擇2012年11月至2013年10月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科住院選擇剖宮產(chǎn)終止妊娠的新生兒作為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)： ①孕婦懷孕前和孕期無疾病，新生兒無先天性畸形； ②孕婦懷孕前和孕期沒有吸煙、喝酒和藥物濫用； ③孕期沒有藥物攝入。所有參與者均被告知研究內(nèi)容并簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。早產(chǎn)兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》的定義：妊娠滿28周，但不滿37周的活產(chǎn)嬰兒。同時對妊娠期進行分組：妊娠28～32周為重度早產(chǎn)組；妊娠32～36周為輕度早產(chǎn)組； 妊娠滿37周為足月產(chǎn)組[11]。最終共有814例新生兒納入本研究，其中24例為重度早產(chǎn)，134例為輕度早產(chǎn)，656例為足月產(chǎn)。

二、研究方法

(一)標(biāo)本與一般資料的采集

取得所有參與者同意，在孕婦剖腹產(chǎn)手術(shù)中于臍帶抽取4～5 mL臍帶血。血樣放入4℃冰箱保存，24 h后離心取血清。離心機參數(shù)：溫度4℃，轉(zhuǎn)速4 000/min，時間5 min。取離心后的血清1～1.5 mL，編碼后放入-80℃冰箱保存，統(tǒng)一待檢。由專業(yè)產(chǎn)科醫(yī)生完成新生兒一般資料的采集并記錄，包括性別、胎齡、出生體重、頭圍和身長。

(二)實驗步驟

25-(OH)-D血清濃度及骨代謝標(biāo)志物濃度的測定使用人25-(OH)-D ELISA試劑盒及OPG、PTH和CTX ELISA試劑盒，向預(yù)先包被抗體的酶標(biāo)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和HRP標(biāo)記的抗體，經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的組分，然后再加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與ELISA試劑盒中樣品的濃度呈正比。操作步驟： ①使用前，將各種試劑充分混勻； ②加樣：向每個反應(yīng)孔中加入50 μL稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)，再加入生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板輕輕振蕩混勻，37℃孵育1 h。倒凈孔內(nèi)液體，手動洗板4次,每次30 s； ③加酶標(biāo)抗體：每孔加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體，輕輕振蕩混勻，37℃孵育30 min。倒凈孔內(nèi)液體，手動洗板4次，每次30 s； ④加底物液顯色：將底物溶液A、 B各50 μL加入各反應(yīng)孔，振蕩混勻，37℃孵育10 min； ⑤終止反應(yīng)：將50 μL終止液加入各反應(yīng)孔； ⑥測定數(shù)值：在ELISA檢測儀上，于450 nm波長處測定各孔的OD值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般情況

814例新生兒中男性432例，女性378例；平均胎齡(37.66±2.15)周。新生兒平均出生體重(3 154.45±687.96)g，平均身長(49.28±3.82)cm，平均頭圍(34.45±2.27)cm，平均胸圍(33.30±3.01)cm。平均血清25-(OH)-D水平(58.88±33.15)nmol/L，平均血清OPG水平(2.43±1.25)ng/L，平均血清PTH水平(13.63±8.48)pg/mL，平均血清CTX水平(0.40±0.20)ng/mL。

二、各孕期組指標(biāo)比較

三組新生兒體重、身長、頭圍、胸圍、25-(OH)-D 水平、OPG、PTH和CTX的統(tǒng)計結(jié)果見表1，足月產(chǎn)組體重、身長、頭圍、胸圍大于重度和輕度早產(chǎn)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。三組間25-(OH)-D和PTH水平均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。重度早產(chǎn)組與足月產(chǎn)組、重度早產(chǎn)組與輕度早產(chǎn)組OPG水平之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但輕度早產(chǎn)組與足月產(chǎn)組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，三組間CTX水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

三、早產(chǎn)組維生素D與OPG、PTH、CTX的相關(guān)性

對早產(chǎn)組中共158例早產(chǎn)兒進行25-(OH)-D與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示維生素D濃度與OPG、CTX的濃度呈正相關(guān)(r=0.385，P<0.05;r=0.319，P<0.05)，見圖1A、圖1C；25-(OH)-D與PTH濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.500，P<0.05)，見圖1B。OPG與PTH的濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.457，P<0.05)，與CTX濃度呈正相關(guān)(r=0.364，P<0.05)。PTH與CTX濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.484，P<0.05)。

表1 不同孕產(chǎn)期組中新生兒體格測量和實驗室指標(biāo)的比較(x±s)Table1 Comparisonofneonatalphysicalmeasurementsandlaboratoryindicesindifferentpregnantgroups分組體重(g)身長(cm)頭圍(cm)胸圍(cm)25-(OH)-D(nmol/L)OPG(ng/L)PTH(pg/mL)CTX(ng/mL)重度早產(chǎn)組1745.04±756.49B41.75±3.65B29.50±3.13B26.66±4.05B30.13±22.33B1.57±0.94B28.18±7.76B0.35±0.14輕度早產(chǎn)組2402.19±569.67C45.80±3.65C32.54±2.26C30.29±3.10C50.39±25.972.36±1.17C22.16±10.78C0.38±0.18足月產(chǎn)組3361.31±515.18A50.30±2.94A35.03±1.71A34.17±2.05A61.63±34.02A2.48±1.27A11.35±5.98A0.40±0.18F值364.83185.00184.68252.6916.256.45183.161.36P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.050.26 注 A代表F檢驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義的基礎(chǔ)上進行兩兩比較時與重度早產(chǎn)組結(jié)果存在差異;B代表F檢驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義的基礎(chǔ)上進行兩兩比較時與輕度早產(chǎn)組結(jié)果存在差異;C代表F檢驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義的基礎(chǔ)上進行兩兩比較時與足月產(chǎn)組結(jié)果存在差異。

圖1 早產(chǎn)組中維生素D與骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性

Fig.1 Correlation between vitamin D and bone metabolic markers of two preterm groups

討 論

早產(chǎn)是威脅新生兒健康的重要因素，而MBD為早產(chǎn)引起的骨生化改變之一。胎兒期是骨骼發(fā)育最迅速的時期，同時在妊娠晚期胎兒的礦物質(zhì)累積達(dá)到最大值。但早產(chǎn)兒由于過早失去胎盤的營養(yǎng)供給，導(dǎo)致其礦物質(zhì)累積減少，使其成為骨代謝疾病的高危群體[1,5]。代謝性骨病通常發(fā)生在出生后6～16周，一般在骨礦化嚴(yán)重丟失后才出現(xiàn)臨床癥狀，但是隨著人們對該類疾病的重視程度不斷增加，MBD的診斷時間越來越早[4,12]。MBD并發(fā)癥包括骨折風(fēng)險增加、呼吸功能受損和早產(chǎn)兒近視，其中骨折為MBD的主要并發(fā)癥，且胎齡越小MBD的患病率越高，骨折發(fā)生率也越高[3,13]。既往早產(chǎn)兒長骨和肋骨骨折的發(fā)生率為10%～32%，但隨著對MBD的關(guān)注程度增加，通過有針對性的護理及治療干預(yù)，目前骨折的發(fā)生率較之前明顯降低[14]。由此可見，加強對MBD的認(rèn)識對改善早產(chǎn)兒的骨骼健康有重要意義。

骨代謝標(biāo)志物是檢測骨質(zhì)形成及成骨破骨狀態(tài)的重要指標(biāo)，骨代謝標(biāo)志物來源于骨代謝過程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，這些標(biāo)志物能有效評估骨骼生長發(fā)育狀態(tài)，為臨床疾病診治提供有效依據(jù)。

OPG是一種成骨細(xì)胞分泌的生長因子受體，對骨細(xì)胞的生物學(xué)作用為抑制成熟破骨細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。有學(xué)者指出OPG對主要參與骨吸收過程中組織蛋白酶K的表達(dá)有明顯的抑制作用[15]。Hauser等[16]研究發(fā)現(xiàn)，OPG與髂骨骨密度和髖關(guān)節(jié)骨折密切相關(guān)，在髖關(guān)節(jié)骨折的患者中OPG低表達(dá)可能是導(dǎo)致骨量流失的因素，說明OPG與骨量的維持密切相關(guān)。PTH能促進破骨細(xì)胞的增殖和分化，而破骨細(xì)胞能加速骨骼去礦物化的進程。Hong等[17]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性PTH的增加與骨密度降低相關(guān)，內(nèi)源性PTH過多對皮質(zhì)骨和小梁骨均有分解代謝作用。而早產(chǎn)兒骨骼的礦化程度相對不足，PTH增高會進一步導(dǎo)致早產(chǎn)兒骨骼破壞和骨量減少。Czech等[18]在一項早產(chǎn)兒的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，PTH是一種簡單的骨代謝疾病的早期標(biāo)志物，與骨量呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，重度早產(chǎn)組和輕度早產(chǎn)組的PTH水平高于足月產(chǎn)組，重度早產(chǎn)組的OPG水平明顯低于足月產(chǎn)組。故本研究認(rèn)為早產(chǎn)兒OPG降低，不能有效抑制破骨細(xì)胞的分化和活化成骨細(xì)胞，同時PTH升高使得破骨細(xì)胞異?；钴S，加劇了早產(chǎn)兒骨質(zhì)的破壞和骨量的流失。

CTX是骨吸收過程中破骨細(xì)胞酶解Ⅰ型膠原的產(chǎn)物，是骨吸收特異且敏感的指標(biāo)，對骨骼和軟骨的生長起著至關(guān)重要的作用。Shiff等[19]研究發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)低體重兒CTX水平低于正常水平。本研究結(jié)果顯示，三組間CTX水平無顯著性差異，與之前研究結(jié)果不同，可能與本研究中重度早產(chǎn)組的病例數(shù)較少有關(guān)，可在后續(xù)的前瞻性研究中增加重度早產(chǎn)兒的病例數(shù)，進一步論證早產(chǎn)與CTX之間的相關(guān)性。

維生素D是一種脂溶性維生素，其最重要的作用是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進鈣的吸收、重吸收和鈣在骨骼的沉積。有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D不僅能促進鈣吸收，而且能活化成骨細(xì)胞功能，影響新生兒骨質(zhì)形成，同時能夠阻止PTH的釋放并防止MBD[20]。Ramon等[21]研究發(fā)現(xiàn)，25-(OH)-D水平較低時MBD風(fēng)險增加，且25-(OH)-D水平高于70 nmol/L時似乎可以預(yù)防嚴(yán)重MBD的進展。同時，孕晚期的3個月至關(guān)重要，因為胎兒在25～40周獲得了80%左右的鈣磷儲備[22]。由于早產(chǎn)多發(fā)生在這一時期，新生兒將部分或完全錯過獲取鈣磷儲備的最佳階段[23]。近期研究表明，妊娠25～35周早產(chǎn)兒的維生素D水平受胎齡影響顯著，這表明早產(chǎn)也會影響新生兒的維生素D儲備[24]。此外，胎齡越小，器官系統(tǒng)越不成熟，需要藥物干預(yù)的可能性就越大。使用氨茶堿、利尿劑和類固醇激素也會導(dǎo)致骨礦物質(zhì)的流失以及鈣和磷代謝紊亂[25]。本研究結(jié)果顯示，重度早產(chǎn)組和輕度早產(chǎn)組的維生素D水平明顯低于足月產(chǎn)組，進一步說明，早產(chǎn)兒維生素D儲備低下，不能有效阻止PTH的釋放，而PTH可以活化破骨細(xì)胞功能，促進新生兒骨質(zhì)破壞和BDM的發(fā)生和進展。因此，早產(chǎn)兒MBD的發(fā)病率高可能與維生素D水平較低相關(guān)。

新生兒骨量儲備、骨量的增加高峰出現(xiàn)在妊娠中晚期，胎兒骨量狀態(tài)、骨質(zhì)強度、破骨和成骨動態(tài)平衡均與胎齡相關(guān)，其中成骨活動與破骨活動應(yīng)處于動態(tài)平衡中，兩者相互調(diào)節(jié)、相互影響[5]。本研究結(jié)果顯示早產(chǎn)兒OPG和CTX的水平呈正相關(guān)，兩者與PTH均呈負(fù)相關(guān)，由此推斷，早產(chǎn)兒PTH含量高，破骨活動異?？哼M，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞；同時OPG和CTX相對降低，導(dǎo)致成骨作用相對減弱，不能有效增加骨量，從而引起早產(chǎn)兒MBD。維生素D不僅通過鈣腸吸收而影響骨質(zhì)沉積，近期研究表明維生素D還可直接作用于骨代謝標(biāo)志物而直接影響成骨破骨功能。Nakamichi等[26]研究發(fā)現(xiàn)通過增加小鼠1α，25-(OH)-D3(維生素D的活化形態(tài))的含量可直接刺激小鼠成骨細(xì)胞的形成，該研究認(rèn)為這是維生素D參與骨礦物沉積及骨重建的主要途徑，因此新生兒維生素D缺乏很可能導(dǎo)致新生兒骨形成障礙。有學(xué)者認(rèn)為新生兒低維生素D水平不但影響新生兒骨質(zhì)形成，甚至可減少青少年時期的骨量峰值[27,28]。本研究顯示，早產(chǎn)兒中維生素D濃度、OPG與CTX的濃度三者互為正相關(guān)，與PTH濃度呈負(fù)相關(guān)，同時早產(chǎn)組維生素D水平明顯低于足月組，以上數(shù)據(jù)提示，早產(chǎn)兒中的低維生素D水平與骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的水平密切相關(guān)。因此，低維生素D水平可能通過抑制OPG和CTX的升高，抑制成骨活動，也可能調(diào)控PTH升高，激活破骨活動而增加骨量流失，從而導(dǎo)致早產(chǎn)兒成骨功能障礙及骨量減少，導(dǎo)致MBD的發(fā)生。

綜上所述，早產(chǎn)兒維生素D和OPG水平較足月兒低，同時PTH水平較高，提示早產(chǎn)兒成骨活動障礙及破骨活動亢進可能是其易患代謝性骨病的關(guān)鍵因素。研究表明維生素D與骨代謝標(biāo)志物密切相關(guān)，說明維生素D缺乏可能是代謝性骨病的原因之一。本研究還提示，監(jiān)測血清25-(OH)-D、OPG、PTH和CTX水平能很好地反映新生兒(特別是早產(chǎn)兒)骨代謝狀態(tài)，并可用于指導(dǎo)早產(chǎn)兒維生素D的添加，以幫助早產(chǎn)兒增加骨量。