王帆，王松華，薛蘋蘋

(上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001)

桑天牛(AprionagermariHope)屬鞘翅目天?？茰厦勌炫喛?，在我國大部分地區(qū)均有分布[1]。因其幼蟲蛀食樹干，對桑、無花果、白楊等危害嚴(yán)重，并可為害柳、構(gòu)樹、蘋果、枇杷、櫻桃、柑橘等樹木，是重要害蟲。桑天牛成蟲將卵多產(chǎn)于1年生的樹皮內(nèi)，孵化后幼蟲在枝干內(nèi)蛀食。由于樹木內(nèi)含有很多木質(zhì)纖維素等物質(zhì)，這些物質(zhì)不易利用，天牛幼蟲必須借助消化系統(tǒng)消化獲取營養(yǎng)。一般認(rèn)為，天牛幼蟲腸道微生物中的細(xì)菌、真菌具有木質(zhì)纖維素降解功能，如松墨天牛(Monochamusalternatus)中最優(yōu)勢纖維素降解菌為噬纖維細(xì)菌科細(xì)菌(Siphonobacteraquaeclarae)[2]。而桑天牛成蟲腸道中的優(yōu)勢菌群為產(chǎn)酸雷克伯氏菌(Klebsieelaoxytoca)，其次為粘滯沙雷氏菌(Serratiamarcescens),其中前者可能具有降低桑天牛腸道pH的作用[3]。桑天牛腸道是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所，同時(shí)也為腸道微生物提供生存環(huán)境。但大多數(shù)研究人員關(guān)注天牛腸道腸道微生物的研究，卻很少關(guān)注天牛幼蟲腸道結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)。

昆蟲腸道可分為前腸，中腸，后腸三部分[4]。早在1987年，殷幼平就對天?？葡肋M(jìn)行了比較解剖學(xué)研究，并指出其可作為天牛分類的依據(jù)[5]。之后周嘉熹和張克斌也對光肩星天牛和黃斑星天牛幼蟲消化道外形進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黃斑星天牛的消化道短于光肩星天牛，特別是中腸，但黃斑星天牛的中腸膨大部的皺褶較多[6]。李小平等對桑天牛幼蟲進(jìn)行了消化系統(tǒng)組織和形態(tài)學(xué)的觀察，且對桑天牛前腸、中腸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行描述[7]。但以上研究，均因技術(shù)和方法的限制，沒有對腸道細(xì)胞進(jìn)行深入研究來探討天牛幼蟲腸道細(xì)胞生物學(xué)特征與消化吸收難以利用的木質(zhì)纖維素。另外，王瑩曾對9種天牛幼蟲的腸道長度和體長做了研究，發(fā)現(xiàn)9種天牛幼蟲消化道均長于體長，最長的光肩星天牛腸道是體長的2.4倍[8]。因此，對天牛腸道不同部位進(jìn)行分段細(xì)胞生物學(xué)比較研究，十分必要。因此，本試驗(yàn)對桑田牛幼蟲進(jìn)行分段切片觀察，試圖深入解析桑天牛幼蟲的腸道結(jié)構(gòu)，為桑天牛害蟲生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

體式顯微鏡，輪式切片機(jī)，烘箱，烤片機(jī)，顯微鏡，數(shù)碼相機(jī)，等。

1.2 主要試劑

石蠟，8.5 g/L NaCl溶液，乙醇，二甲苯，蒸餾水，蘇木素-伊紅染色試劑盒，甘油明膠封片劑，多巴胺。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桑天牛幼蟲的捕捉

桑天牛幼蟲于2018年12月在上饒師范學(xué)院校園內(nèi)楊樹枝干內(nèi)捕捉，捕捉之后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 腸道組織多酚氧化酶活性染色

對桑天牛幼蟲進(jìn)行低溫麻醉，之后在解剖盤上進(jìn)行解剖。解剖開皮膚以后，用8.5 g/L NaCl溶液沖洗3次，取出完整腸道。放入含有10 mmol/L多巴胺的30%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中浸泡4～5 h，待前腸和后腸黑化之后拍照。

1.3.3 石蠟切片

取出完整的幼蟲腸道，將前腸、中腸1(MG1)、中腸2(MG2)、中腸3(MG3)、中腸4(MG4)、后腸1(HG1)與后腸2(HG2)分別用固定液在4 ℃條件下固定12 h。固定液：30%(體積分?jǐn)?shù))三氯甲烷、60%(體積分?jǐn)?shù))無水乙醇，10%(體積分?jǐn)?shù))乙酸。將固定液去除，加無水乙醇進(jìn)行脫水3次，每次15 min。二甲苯透明2次，每次10 min。最后在液體石蠟中65 ℃包埋12 h。之后進(jìn)行修蠟，切片，切片厚度5 μm。將組織切片在載玻片上展片，42 ℃烤片12 h。

1.3.4 蘇木素-伊紅(HE)染色

將帶有組織的載玻片在二甲苯溶液中脫蠟2次，每次15 min。之后將玻片依次在無水乙醇、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇浸泡5 min。之后在ddH2O中浸泡2次，每次3 min。將載玻片從ddH2O中取出，吸去載玻片上多余ddH2O，進(jìn)行蘇木素染色8 min，放ddH2O中浸泡10 min，95%乙醇中5 s。進(jìn)行伊紅染色3 min。在70%乙醇中浸泡2次，每次3 min。最后，滴加永久封片劑，蓋上蓋玻片進(jìn)行封片，在顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑天牛幼蟲消化道形態(tài)特征

天牛幼蟲的腸道長度長于體長，與其它昆蟲腸道長度相比差異明顯。對桑天牛幼蟲進(jìn)行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1A所示，前腸(FG)很短，中腸最長，將其分為MG1、MG2、MG3、MG4 4段。后腸次之，分為HG1，HG2兩段。昆蟲腸道中有多酚氧化酶表達(dá)，用以對食物中的酚類物質(zhì)進(jìn)行解毒與誘導(dǎo)糞便黑化[9-10]。腸道組織中的多酚氧化酶原可以被酒精特異性激活，將桑天牛幼蟲腸道在30%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、10 mmol/L 多巴胺溶液中染色，發(fā)現(xiàn)FG有多酚氧化酶表達(dá)可以染黑，后腸HG1前部可以染黑，HG2可以染黑，但HG1后部不能染黑(圖1B)，說明此部位沒有多酚氧化酶表達(dá)。由于后腸表達(dá)的多酚氧化酶可以殺死腸道內(nèi)的微生物[10]，推測HG1后部有特異的細(xì)菌定殖，且這種菌對桑天牛有益。

2.2 桑天牛幼蟲消化道形態(tài)特征

昆蟲前腸具有暫時(shí)儲存、磨碎食物的功能，其包括口、咽、食道、嗉囊、前胃等部位。對桑天牛幼蟲前腸進(jìn)行切片，其前腸組織從外到內(nèi)依次為環(huán)肌、縱肌、底模、腸壁細(xì)胞、內(nèi)膜等結(jié)構(gòu)(圖2A)。但對桑天牛前腸切片進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，前腸內(nèi)膜上有許多微小的齒狀結(jié)構(gòu)(圖2B)，推測和磨碎堅(jiān)硬的木質(zhì)食物有關(guān)。

A.桑天牛幼蟲腸道分段; B.桑天牛幼蟲腸道多酚氧化酶檢測。

A.前腸橫切圖； B.A圖中方框放大圖； C.MG1組織橫切圖；D.MG2組織橫切圖； E.MG3組織橫切圖； F.MG4組織橫切圖。圖2 桑天牛幼蟲前腸和中腸組織結(jié)構(gòu)

中腸是昆蟲消化吸收營養(yǎng)的主要場所，上接前腸，下與后腸相連。研究表明，桑天牛幼蟲的中腸較長，將其分為4段(圖1)。MG1段靠近前腸，為膨大部，其HE染色結(jié)果如圖2C所示。昆蟲中腸細(xì)胞主要由腸道干細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和柱狀細(xì)胞組成。對MG1部位腸道結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，此處中腸有許多皺褶，推測其可增加與腸道內(nèi)容物接觸的表面積，以致快速吸收食物中的有用物質(zhì)(圖2C)。MG2部位有明顯的腸絨毛(圖2D)，且柱狀細(xì)胞占比較大。MG3部位和MG2部位差異明顯，由圖中可以看出，內(nèi)分泌細(xì)胞分泌非常旺盛，整個(gè)腸腔內(nèi)充滿分泌小泡，這種分泌小泡內(nèi)的物質(zhì)可能是消化酶(圖2E)。MG4部位的腸道細(xì)胞雖與MG3類似，但稍有不同，表現(xiàn)在腸道細(xì)胞中內(nèi)分泌細(xì)胞所占比例明顯增多，但中腸腸腔內(nèi)沒有大量分泌物質(zhì)，推測兩部位分泌物質(zhì)不同，且MG4部位的柱狀細(xì)胞沒有MG3部位典型(圖2F)。

后腸是排泄器官，后腸的功能是回收水分和無機(jī)鹽。通過觀察，桑天牛幼蟲后腸很長，但HG2比HG1短，HG1的結(jié)構(gòu)如圖3A所示，與內(nèi)膜連接的是一層上皮細(xì)胞(圖3B)；HG2結(jié)構(gòu)如圖3C所示，其內(nèi)膜比HG1要厚，且6個(gè)直腸墊結(jié)構(gòu)非常明顯；桑天牛幼蟲后腸HG2腸道內(nèi)有隱腎管，有助于水分和無機(jī)鹽的重吸收。

A.后腸前部組織(HG1)橫切圖; B.圖A中紅色方框放大圖; C.后腸后部組織(HG2)橫切圖。

3 結(jié)論

昆蟲腸道是消化、吸收和排泄的器官，是昆蟲重要的組織結(jié)構(gòu)。其前腸和后腸由外胚層發(fā)育而來，二者在結(jié)構(gòu)上類似，而中腸起源于內(nèi)胚層。由于不同種類的昆蟲生存環(huán)境和食性等不同，各類昆蟲的消化道有很大變異。果蠅的中腸可分為前中腸(anterior midgut，AM)、銅細(xì)胞區(qū)域(copper cell region，CCR)和中后腸(posterior midgut，PM)等，其不同部位存在的干細(xì)胞也有差別，如CCR區(qū)的干細(xì)胞為胃腸干細(xì)胞，PM區(qū)的干細(xì)胞是腸道干細(xì)胞[11]。天牛幼蟲腸道大于體長，與其它昆蟲相差較大，而具體某一區(qū)段的腸道結(jié)構(gòu)研究還鮮有報(bào)道。本文對桑天牛幼蟲不同部位的腸道進(jìn)行解剖、切片、染色、觀察，發(fā)現(xiàn)桑天牛幼蟲前腸和后腸有多酚氧化酶表達(dá)來幫助其分解植物酚類物質(zhì)。根據(jù)桑天牛中腸形態(tài)和在體腔內(nèi)分布狀況，可分為4個(gè)部分。此4個(gè)部分的中腸腸道結(jié)構(gòu)有明顯差別，如MG1腸道褶皺較多，MG2腸道細(xì)胞的腸絨毛豐富，MG3腸腔內(nèi)充滿大量分泌小泡，MG4的內(nèi)分泌細(xì)胞較多。桑天牛幼蟲4個(gè)部分的中腸腸道結(jié)構(gòu)特征可能與消化木質(zhì)素有關(guān)。Scully等對星天牛轉(zhuǎn)錄組幼蟲中腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，180個(gè)單基因編碼糖苷水解酶類(GHs)。包括幾種GH5、45和48纖維素酶，GH1木聚糖酶，GH1 b-葡糖苷酶；并且發(fā)現(xiàn)有一些植物宿主防御化學(xué)物質(zhì)解毒酶[12]。然而Scully等將整個(gè)中腸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并沒有分段取樣，鑒于中腸結(jié)構(gòu)的差異，有必要對其蛋白質(zhì)組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分段深入研究。本研究對蛀干類害蟲天牛幼蟲的腸道結(jié)構(gòu)研究有一定幫助。