付新亮，方 博，蔡孟楷，黃俊明，卜德新，張桂紅*

（1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 動物科技學院，廣東 廣州 510225；2. 華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642；3. 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東 廣州 510642）

豬流感（Swine influenza，SI）是由豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起豬的一種急性呼吸道傳染病。由于豬的呼吸道既有SA α-2,3-Gal 唾液酸受體，又有SA α-2, 6-Gal 唾液酸受體分布[1]，豬的這種受體分布特性使得其既可以感染禽流感病毒（AIV），又可以感染人流感病毒，進而在豬體內(nèi)產(chǎn)生新的重組病毒，因此豬被稱為流感病毒的“混合器”[1]，在流感病毒“禽-豬-人”的傳播鏈中發(fā)揮著重要作用，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。目前在豬群中流行的SIV主要有H1N1、H1N2和H3N2 3種亞型，其中H1 亞型SIV 又分為經(jīng)典豬流感（Classical Swine H1N1，CS）、歐亞類禽（Eurasian-avian like，EA）、pdm09和人季節(jié)性流感（Human-like）分支[2-3]，而歐亞類禽分支SIV已經(jīng)成為豬群中的優(yōu)勢病毒株[4]。為了解和掌握華南地區(qū)豬群中SIV 的流行及其變異、重組和遺傳演化規(guī)律等，本研究從病原學和血清學兩個方面對2016年～2017年華南地區(qū)豬群開展流行病學調(diào)查，以期為SIV 的防控和疫苗株的篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與病毒株 豬肺臟病料組織236 份，豬鼻拭子樣品143 份采集自2016 年～2017 年華南地區(qū)豬場；3 265 份血清樣品采集自華南地區(qū)豬場中未免疫SI 疫苗豬群，并對血清采集時間進行統(tǒng)計，用于SIV 流行的季節(jié)性特點分析。甲型H1N1pdm09 分支[A/Guangdong/1057/2010（pdm09 H1N1）]，歐亞類禽豬 流 感 分 支[A/swine/Guangdong/SS1/2012（EA H1N1）]，H3N2 亞 型SIV[A/swine/Guangdong/L22/2010（H3N2）]，H9N2 亞 型AIV Beijing-94 like 分 支[A/chicken/Guangdong/V/2008（H9N2）]，H5N1 亞 型AIV 2.3.2.1 分 支[A/chicken/Guangdong/178/2004（H5N1）]， H7N9 亞型AIV[A/chicken/Guangdong/G2/2013（H7N9）]等血清學調(diào)查所用病毒株，其中H1N1 和H3N2 亞型SIV 由本實驗室分離保存，H9N2、H5N1 和H7N9 亞型AIV由華南農(nóng)業(yè)大學禽病教研室廖明教授和亓文寶教授惠贈。

1.2 主要試劑 TRIzol RNA 提取試劑購自Thermo-Fisher 公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、PrimeStar HS DNA Polymerase、pMD18-T、DL2000 DNA Marker 和DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司；E. coli DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司；RDE 受體破壞酶購自日本生研公司。

1.3 病毒分離及鑒定 病料組織經(jīng)研磨后4 ℃離心取上清，鼻拭子樣品置于DMEM培養(yǎng)基中經(jīng)震蕩混勻后離心取上清。利用TRIzol 法提取病料組織和鼻拭子樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后通過流感病毒M 基因檢測引物進行PCR 檢測[3]。經(jīng)PCR 鑒定為陽性的樣品接種SPF雞胚進行PCR病毒分離，并進行血凝試驗鑒定。

1.4 病毒分離株分子特征分析及遺傳演化分析 利用流感病毒8 個節(jié)段特異性引物對病毒分離株進行全基因組擴增[3]，PCR 擴增產(chǎn)物回收后連接至pMD18-T 載體，由華大基因測序。應用DNAStar 分析軟件對病毒分離株8 個基因節(jié)段進行序列比對分析、核苷酸和氨基酸同源性分析及分子特征分析，并利用MEGA5.0對8個基因節(jié)段構建遺傳進化樹，進行遺傳演化分析。

1.5 血清抗體測定及統(tǒng)計分析 將3 265 份待檢血清樣品分別與RDE 酶按1∶4 比例混合，37 ℃孵育過夜，置于56 ℃滅活30 min，以去除血清中的非特異性凝血因子。通過HI 試驗測定血清樣品中H1N1、H3N2 亞型SIV 及H9N2、H5N1 和H7N9 亞型流感病毒的抗體滴度[5]，HI效價大于或等于1∶40 時，判定為血清樣品HI 抗體陽性。通過GraphPad Prism 和SPSS 軟件對豬群中不同亞型流感病毒的血清陽性率、血清抗體滴度（幾何平均滴度±標準差）、混合感染情況及季節(jié)性流行特點進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 病毒分離鑒定 從236 份肺臟組織樣品和143份鼻拭子樣品中通過RT-PCR 方法共檢測到3 份流感病毒陽性樣品，接種雞胚和細胞后分離得到3 株SIV，分別命名為A/Swine/Guangxi/NK/2016、A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017 和A/Swine/Fujian/NP/2017。對3個分離株分別進行全基因組測序，并對其HA 和NA基因進行BLAST 比對分析，結果顯示3 個分離株均與H1N1 亞型流感病毒同源性最高，表明3 株SIV 均為H1N1 亞型。

2.2 病毒分離株同源性和分子特征分析 3 個病毒分離株HA 蛋白氨基酸同源性約為96.6%～97.9%，與H1 亞型SIV 參考株中的歐亞類禽病毒株同源性最高，其同源性約為89%～98.4%；3 個病毒株NA 蛋白的氨基酸同源性約為94.9%～96.6%，同樣與歐亞類禽病毒株同源性最高。對HA蛋白分子特征分析結果顯示，A/Swine/Fujian/NP/2017 和A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017與其它歐亞類禽病毒株一樣，在HA蛋白的第10、11、23、195、274、481和540位有7個潛在的糖基化位點，而A/Swine/GuangXi/NK/2016在第23位糖基化位點發(fā)生了缺失。3 個分離株HA 蛋白在第216、222 和224 位分別為Ala、Glu 和Ala，表現(xiàn)出偏向結合禽類α-2,3受體的特性，其HA蛋白裂解位點處的氨基酸序列均為PSIQSR↓GLT，無堿性氨基酸的插入，呈現(xiàn)低致病性的特性。對PB1 蛋白的分子特征分析結果顯示，3 個病毒株PB1 蛋白與pdm09 株一樣發(fā)生了Leu473Val 突變，經(jīng)典豬流感和人季節(jié)性流感分支的病毒株在473 位為Leu，而PB1 蛋白Leu473Val 突變可增強流感病毒在哺乳動物細胞中的復制能力。

2.3 病毒分離株遺傳演化和重組分析 HA 和NA基因遺傳演化分析結果顯示，3個分離株的HA和NA基因均位于歐亞類禽分支，與近幾年國內(nèi)的分離株遺傳進化關系較近（圖1），HA 和NA 基因遺傳演化分析結果與氨基酸同源性分析結果相符。其它6 個基因（PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因）遺傳演化分析結果顯示，3個分離株的PB2、PB1和PA基因、A/Swine/GuangXi/NK/2016的NP和M基因、A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017 的M 基因、A/Swine/Fujian/NP/2017 的NP 基因均屬于pdm09 分支；A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017的NP 和NS 基 因 以 及A/Swine/Fujian/NP/2017 的M 和NS 基因均屬于歐亞類禽分支，而A/Swine/GuangXi/NK/2016 的NS 基因?qū)儆诮?jīng)典豬流感分支（圖略）。

圖1 HA（A）和NA（B）基因遺傳演化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of HA(A)and NA(B)gene

對3 個病毒株8 個基因節(jié)段的遺傳演化分析結果顯示，A/Swine/Fujian/NP/2017 由歐亞類禽、pdm09 和經(jīng)典豬流感3個不同分支重組而來，而A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017 和A/Swine/Fujian/NP/2017 由 歐 亞 類 禽和pdm09 重組而來（圖2），表明SIV 歐亞類禽分支病毒株與pdm09 株之間的重組現(xiàn)象已經(jīng)非常普遍。

圖2 病毒分離株基因重組示意圖Fig.2 The diagram of gene reassortment for SIV identified strains

2.4 豬群中流感病毒血清抗體監(jiān)測結果 利用HI試驗對2016 年7 月～2017 年6 月間從華南地區(qū)豬群采集的3 265 份血清樣品進行SIV 抗體檢測，檢測所用的抗原類型包括H1N1（EA 分支和pdm09 分支）、H3N2、H9N2、H5N1 和H7N9 亞型，各亞型的血清抗體陽性率如表1 所示。EA H1N1、pdm09 H1N1 和H3N2 SIV 的血清抗體陽性率分別為27.53%（899份）、20.98%（685 份）、34.85%（1138 份），其中H3N2 亞型SIV 血清抗體陽性率最高（p＜0.01），其次是歐亞類禽分支。另外，還檢測到21 份血清樣品呈H9N2 亞型抗體陽性，陽性率為0.64%，但H5N1 和H7N9 抗體均為陰性。豬群中不同亞型和不同分支SIV 之間混合感染的情況也很普遍，其中EA H1N1 和pdm09 之間以及EA H1N1 和H3N2 SIV 之間混合感染率較高，分別為11.3%（369 份）和10.01%（327 份）。另外，還有4.65%（152 份）的血清樣品可以同時檢測到EA H1N1、pdm09 和H3N2 3 種SIV 的抗體。表明H1N1和H3N2 亞型SIV 在華南地區(qū)豬群中的流行及混合感染情況較為嚴重。

表1 不同亞型SIV HI 抗體檢測結果Table 1 HI titer of different subtype SIV in swine serum samples

2.5 不同亞型流感病毒HI 抗體滴度分布 統(tǒng)計各亞型HI 抗體滴度的分布情況，并通過GraphPad Prism 軟件繪制HI 抗體滴度分布圖，計算其幾何平均滴度（GMT）和標準誤差，結果如圖3 所示。EA H1N1、pdm09 和H3N2 亞 型SIV HI 抗 體 的GMT 分 別為118.2±9.8（95%CI:110.7～126.2）、139.9±12.7（95%CI: 128.8～152）和138.6±5.9（95% CI: 132.1～145.3），H9N2 亞型HI 抗體的GMT 為77.4±3.4（95% CI: 58.9～101.7）。其中EA H1N1、pdm09 和H3N2 亞型SIV HI抗體滴度最高均可達到1∶1 280，而H9N2 亞型HI 抗體滴度最高為1∶160。表明H9N2 AIV 雖然可以感染豬，但對豬還不適應。

圖3 不同亞型流感病毒血清HI 抗體滴度分布情況Fig.3 The distribution of HI titer for different subtype SIV

2.6 SIV 季節(jié)性流行特點分析 為了解SIV 的季節(jié)性流行特點，本研究對不同亞型或分支SIV 在一年中各月份的血清抗體陽性率進行了統(tǒng)計，結果顯示，3 種SIV 的血清抗體陽性率從9 月或10 月份開始升高，到12 月份或1 月份，血清抗體陽性率達到最高水平。其中EA H1N1 SIV 在12 月份陽性率最高，達到34.72%，pdm09 H1N1 和H3N2 亞型SIV 的血清抗體陽性率均在1 月份達到最高，分別為29.15%和46.53%，隨后血清抗體陽性率明顯降低（圖4）。表明SIV 的流行具有季節(jié)性，并且在冬季（11 月、12月和1 月份）的流行最為嚴重。

圖4 3 種SIV 季節(jié)性流行特點分析Fig.4 Seasonal epidemic feature analysis of three different SIV

3 討 論

自2009 年pdm09 H1N1 甲型流感病毒在人群中暴發(fā)后，許多國家和地區(qū)陸續(xù)從豬群中檢測到該型病毒或者該病毒的特異性抗體[6-9]。隨后pdm09 H1N1甲型流感病毒開始在豬群中穩(wěn)定下來，并在世界范圍內(nèi)的豬群中持續(xù)傳播[10]。此后，pdm09 H1N1 與經(jīng)典豬流感、歐亞類禽分支和H3N2 SIV 一起在豬群中共同流行[11]，并且pdm09 H1N1 與其它SIV 不斷發(fā)生重組，產(chǎn)生新的重組病毒株。朱華晨等在2011 年首次從豬群中分離到pdm09 H1N1 和歐亞類禽分支SIV間的重組病毒，該重組病毒的表面基因來源于歐亞類禽分支，而內(nèi)部基因來源于pdm09 H1N1 SIV[12]。進一步研究證實，該重組病毒可以在豬群之間高效傳播，并且可以從豬傳播至雪貂，表明該重組病毒有從豬傳播給人的潛在威脅[12]。除了pdm09 H1N1 與H1N1亞型SIV 之間的重組外，也有H3N2 亞型SIV 與pdm09 H1N1 SIV 重組的報道，并且重組病毒對豬的致病性以及在豬群之間的傳播能力也顯著增強[13-14]。

本研究從華南地區(qū)豬群采集的肺臟組織和鼻拭子樣品中分離鑒定到3 株SIV，全基因組測序和遺傳演化分析結果顯示3 個分離株均為H1N1 亞型，其HA 和NA 基因均屬于歐亞類禽病毒株，也證實了歐亞類禽分支SIV 是目前我國豬群中的主要流行株[4]。另外，本研究中的3 個分離株均與pdm09 H1N1 SIV發(fā)生了重組，證實了華南地區(qū)豬群中歐亞類禽分支SIV 與pdm09 H1N1 SIV 之間的重組現(xiàn)象非常普遍，并且相關研究表明，歐亞類禽分支SIV 與pdm09 H1N1 SIV 的重組病毒株在豬群之間的傳播能力明顯增強[12]。因此，需要加強對豬群中SIV的變異及其重組的監(jiān)測，為其跨宿主傳播提供相應的預警，并展開相關疫苗的研發(fā)，為豬群中SI的防控提供幫助。值得注意 的 是，A/swine/Guangxi/NK/2016 的HA 蛋 白 第23 位的糖基化位點發(fā)生了缺失，而糖基化位點與流感病毒的傳播能力、抗原性、病毒毒力以及逃避宿主的免疫應答有關[15]，而該病毒株糖基化位點的缺失對病毒生物學特性的影響還需要進一步研究。

另外，本研究還測定了華南地區(qū)豬群中H1N1、H3N2、H9N2、H5N1 和H7N9 這5 種亞型流感病毒的血清抗體陽性率，其中H3N2 亞型SIV 的抗體血清抗體陽性率最高，該結果與之前的研究報道相符[16]。相關研究報道H9N2亞型SIV可以感染豬，并可以通過鼻分泌物向體外排毒，以及引起血清抗體轉(zhuǎn)陽[17]。本研究從華南地區(qū)豬群血清中也檢測到H9N2 亞型流感病毒的抗體，雖然血清抗體陽性率較低，僅為0.64%（21 份），但證實了華南地區(qū)豬群中存在有H9N2 亞型流感病毒感染豬的情況。雖然有零星的關于H5N1 亞型流感病毒感染豬的報道[18]，但在本研究中未檢測到H5N1 和H7N9 亞型流感病毒的特異性抗體。另外，血清抗體檢測結果顯示，豬群中不同亞型和不同分支SIV 之間混合感染的情況也非常普遍。通過對不同亞型SIV 在一年中各月份的血清抗體陽性率進行統(tǒng)計，顯示SIV 在豬群中的流行具有一定的季節(jié)性，主要在冬季（11 月、12 月和1 月份）的流行最為嚴重。本研究可為華南地區(qū)豬群SI防控和疫苗株的篩選提供參考依據(jù)。