1.長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；2.吉林敖東集團力源制藥股份有限公司，吉林 敦化 133700

養(yǎng)血飲顆粒由當歸、黃芪、大棗、鹿角膠、阿膠五種藥味組成，具有補氣養(yǎng)血、益腎助脾的功效[1-3]，是吉林敖東集團力源制藥股份有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒劑產(chǎn)品，現(xiàn)行養(yǎng)血飲顆粒劑標準中含量測定為薄層掃描法[4-6]測定養(yǎng)血飲顆粒中黃芪甲苷的含量，由于薄層掃描法含量測定結果精密度低，重復性差，專屬性差，使質(zhì)量標準陳舊，不能很好的對產(chǎn)品質(zhì)量進行控制，嚴重影響制劑的生產(chǎn)和應用[7-10]，因此，確定養(yǎng)血飲顆粒黃芪甲苷含量測定的合適方法，提高養(yǎng)血飲顆粒的質(zhì)量標準勢在必行，本研究將采用高效液相色譜法，蒸發(fā)光檢測器對養(yǎng)血飲顆粒中黃芪甲苷進行含量測定，提高養(yǎng)血飲顆粒質(zhì)量標準，為該制劑后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent 1260)，蒸發(fā)光檢測器(Agilent，低溫型)；空氣發(fā)生器(XWK-Ⅲ)；Phenomenex Luna C18 (4.6mm×250 mm，5μm)色譜柱；黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，110781-201717，純度96.9%)；養(yǎng)血飲顆粒(吉林敖東集團力源制藥股份有限公司，規(guī)格為5 g/袋，批號180101、180102、180303、190101、190104、190302、090303、190304、190501、190502)乙腈為色譜純；水為超純水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備 取本品，研細，取約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加水30 mL，加熱使溶解，用水飽合正丁醇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按比例取組方中除黃芪以外的其余藥材，按照制備工藝制備陰性樣品，取陰性樣品5 g，按2.1.1方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)性試驗 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(32∶68)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測，空氣發(fā)生器0.4 MPa，漂移管50℃；檢測波長270 nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應不低于5000。精密吸取對照品溶液10 μL，供試品溶液和陰性樣品溶液各15 μL，注入高效液相色譜儀進行測定，結果供試品與黃芪甲苷對照品色譜圖有相同保留時間的色譜峰，陰性無干擾，結果如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

圖3 陰性樣品色譜圖

2.3 方法驗證試驗

2.3.1 線性 精密稱取黃芪甲苷對照品16.58 mg，加甲醇定容至25 mL量瓶中，得濃度為0.6632mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液，該溶液加甲醇等比稀釋制成濃度為0.0663 mg/mL、0.0829 mg/mL、0.1658 mg/mL、0.3316 mg/mL對照品溶液，精密吸取上述5種不同濃度對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀。以對照品進樣量(μg)的常用對數(shù)為橫坐標，峰面積常用對數(shù)為縱坐標繪制標準曲線。結果黃芪甲苷在0.66～6.63μg范圍內(nèi)，Y=1.6659X+2.5421(r=0.9991)，進樣量常用對數(shù)與峰面積常用對數(shù)呈線性關系。

2.3.2 精密度 取同一份供試品溶液(190302)連續(xù)進樣測定6次，每次15μL，測定其色譜峰面積值，RSD為1.58 %，結果表明精密度良好，結果見表1。

表1 精密度結果

2.3.3 重現(xiàn)性 取同一批樣品(190302)，按2.1.1方法平行制備6份供試品溶液，依法進行測定，結果黃芪甲苷含量平均值為0.22 mg/g，RSD值為1.47 %。表明該方法重現(xiàn)性良好，結果見表2。

表2 重現(xiàn)性結果

2.3.4 穩(wěn)定性 取本品(190302)約5 g，按2.1.1方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、12、24 h進行測定，每次進樣量15 μL，RSD為2.61 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，結果見表3。

表3 穩(wěn)定性結果

2.3.5 回收率 精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇溶解，設計3種不同濃度的對照品溶液(低、中、高濃度對照品溶液濃度分別為0.0061 mg/mL、0.0122 mg/mL、0.0183 mg/mL)，每種濃度分別制備3份溶液進行測定，低、中、高濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比分別控制在0.5∶1，1∶1，1.5∶1左右。取本品(190302，含量0.22 mg/g)9份，每份約2.5 g，精密稱定，分別精密加入低、中、高濃度對照品溶液50 mL，依法測定，回收率平均值為97.81 %，RSD為3.94 %，結果表明該方法準確度良好，結果見表4。

表4 回收率結果

2.4 含量測定 取養(yǎng)血飲顆粒10批樣品(批號180101、180102、180303、190101、190104、190302、090303、190304、190501、190502)，按2.1.1方法制備供試品溶液，精密吸取對照品溶液5 μL、10 μL，供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，以外標兩點法計算黃芪甲苷含量，結果見表5。

表5 養(yǎng)血飲顆粒十批樣品黃芪甲苷含量測定結果

3 討論

3.1 樣品的提取[11]以甲醇為提取溶劑，考察超聲提取、回流提取、索氏提取三種提取方法，結果回流提取和索氏提取測定結果無顯著差異且明顯高于超聲提取測定結果，因此采用回流提取方法。并對提取時間和提取溶劑量進行了單因素考察；另外，黃芪中的某些皂苷類成分在堿性條件下可轉化為黃芪甲苷(黃芪皂苷Ⅳ)，因此在處理樣品時，通常使用氨試液對供試品進行堿化，氨試液用量和洗滌次數(shù)在一定程度上影響黃芪甲苷測定結果。參考《中國藥典》2015年版一部黃芪【含量測定】項下供試品制備方法，以氨試液每次用量為40 mL為基礎，對洗滌次數(shù)進行考察，數(shù)據(jù)顯示，氨試液洗滌2次和3次結果無顯著差異且略高于洗滌1次測定結果，因此，采用氨試液洗滌2次的方法。

3.2 色譜條件的選擇 參考《中國藥典》2015年版一部黃芪【含量測定】流動相組成，以乙腈、水為流動相組成并對二者比例進行考察，結果乙腈∶水為38∶62時，黃芪甲苷色譜峰與其他雜峰分離度大于1.5，保留時間適中。因此，確定乙腈∶水(38∶62)為流動相，同時對流速、柱溫、不同色譜柱等色譜條件進行了考察，確定流速為1.0mL/min，柱溫為35 ℃，色譜柱為C18(4.6mm×250 mm,5μm)，漂移管溫度為50 ℃，結果表明本研究方法穩(wěn)定、專屬性強、靈敏度高[12]，適合用于養(yǎng)血飲顆粒中黃芪甲苷的含量測定。