鄭盼盼 肖文璐 黃 浩 武少賢 李 源 鄭 曉 陳陸俊 蔣敬庭 (蘇州大學附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術研究中心，蘇州大學細胞治療研究院,常州 213003)

膽管癌起源于膽道上皮細胞，其異質性很強，是一種惡性程度高、預后差且僅次于肝細胞癌的第二大原發(fā)性肝臟腫瘤[1]。近年來，膽管癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，手術是其主要治療手段，但5年生存率極低，且由于缺乏較好的檢查手段，多數(shù)患者確診即為晚期[2]。因此尋求早期診斷標志物對于膽管癌預后至關重要。黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2,AIM2)是干擾素誘導的HIN-200蛋白家族成員，在結腸癌[3]、乳腺癌[4]和前列腺癌[5]等幾種類型的腫瘤中發(fā)揮抑制作用，但AIM2在膽管癌中的表達情況及其臨床意義尚不明確。因此本研究采用免疫組化檢測膽管癌及正常組織中AIM2的蛋白表達水平，進一步分析其臨床意義及預后價值，為膽管癌診療提供新的生物學標記和治療靶點。

1 材料與方法

1.1材料 膽管癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司(產(chǎn)品批號：HBiDC122Su01),該芯片共含有91例膽管癌組織及其部分正常組織，所有患者均經(jīng)病理診斷為膽管癌，術前均未接受放、化療或其他抗腫瘤輔助治療，收集其性別、年齡、腫瘤直徑、病理分級、遠處轉移、T分期、AJCC第7版TNM分期等臨床病理資料。患者手術時間為2011年12月至2016年8月，隨訪時間截至2017年5月，除去失訪和芯點不完整的病例，共有88例患者可納入研究。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準,并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色 采用EnVisionTM免疫組織化學染色法：將石蠟組織芯片90℃烘片4 h后，依次進行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復，室溫下過氧化氫溶液浸泡30 min，3%牛血清蛋白(BSA)37℃封閉30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后滴加一抗(兔抗人AIM2單抗，1∶150稀釋)，4℃冰箱過夜孵育。第二天取出芯片用PBS溶液洗滌3次，每次5 min，甩凈表面液體后，加辣根過氧化物酶(HRP)標記鼠/兔通用型二抗覆蓋芯片，37℃溫箱孵育30 min，PBS洗滌后加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色，沖洗后用蘇木素復染，冷水缸返藍10 min，梯度乙醇脫水干燥，風干后中性樹膠封片。

1.2.2染色結果判斷 組織芯片染色結果由蘇州大學附屬第三醫(yī)院資深病理醫(yī)師采用H-score法進行評估，以細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物為AIM2陽性染色。H-score=(弱著色的腫瘤細胞百分比×1)+(中度著色的腫瘤細胞百分比×2)+(強著色的腫瘤細胞百分比×3)。

1.3統(tǒng)計學方法 用Wilcoxon秩和檢驗比較配對資料間差異，Pearson方差檢驗比較樣本率差異。生存分析采用Kaplan-Meier法，并擬合Cox回歸分析模型，用風險比(HR)及95%置信區(qū)間(CI)估計AIM2表達水平與膽管癌患者死亡風險的關聯(lián)強度。應用SAS9.4以及R語言3.6.1軟件進行統(tǒng)計學分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1AIM2在膽管癌組織及正常組織中的表達情況 AIM2免疫組化陽性著色主要位于細胞質，在癌組織中以低表達為主，而在正常組織中以高表達為主。見圖1。膽管癌中AIM2的H-score中位數(shù)為230，范圍為30～300，四分位數(shù)(177.5,280)；正常組織AIM2的H-score中位數(shù)為260，范圍為80～300，四分位數(shù)(205,297.5)。Wilcoxon符號秩檢驗表明膽管癌組織H-score顯著低于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 免疫組化檢測AIM2在膽管癌和正常組織中的表達(×200)Fig.1 Immunohistochemistry was used to detect expr-ession of AIM2 in cholangiocarcinoma and normal tissues(×200)

圖2 膽管癌及正常組織AIM2表達水平差異Fig.2 Differences in AIM2 expression between cholangiocarcinoma and normal tissuesNote:*.P<0.05.

2.2AIM2表達與患者臨床病理參數(shù)之間的相關性 以H-score=250為截點值，定義H-score>250為高表達，H-score≤250為低表達。對芯片中88例膽管癌患者的病理資料進行分析，統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)AIM2的表達水平與腫瘤大小(χ2=7.380,P=0.007)呈正相關，差異具有統(tǒng)計學意義；AIM2表達水平與患者其他臨床病理特征無顯著相關性。見表1。

2.3AIM2表達水平在膽管癌患者預后評估中的作用 基于TCGA數(shù)據(jù)庫結果顯示，AIM2高表達的膽管癌患者的總生存期優(yōu)于AIM2低表達的患者。見圖3。此外，結合免疫組化結果，根據(jù)組織芯片隨訪數(shù)據(jù)進行Kaplan-Merier生存分析顯示，AIM2呈高表達水平的膽管癌患者的總存活率顯著高于AIM2呈低表達水平的患者(HR=0.293, 95%CI:0.130～0.662,P=0.002)。見圖4。單因素模型分析顯示，在單因素模型分析中，AIM2表達(HR=0.293，95%CI:0.130～0.662，P=0.002)、年齡(HR=0.167,95%CI:0.068～0.408,P=0.000)和腫瘤大小(HR=3.038,95%CI:1.008～9.152,P=0.048)均與總生存率顯著相關；多因素Cox模型分析結果顯示，AIM2表達水平(HR=0.320,95%CI:0.120～0.853,P=0.023)，性別(HR=2.268,95%CI:1.019～5.044,P=0.045)和年齡(HR=0.180,95%CI:0.070～0.465,P=0.000)可作為患者預后評估的獨立危險因素。見表2。

表1 AIM2表達與膽管癌患者臨床病理特征的關系

Tab.1 Relationship between expression of AIM2 and clinicopathological characteristics of patients with cholangiocarcinoma

ClinicalcharacteristicsCasesAIM2 expression levelH-score≤250H-score>250χ2P valueGender1.5940.207Male453015Female432320Age1.0280.311≤42 years old1082>42 years old784533Pathology classification1.1230.570Ⅰ1275Ⅰ-Ⅱ-Ⅱ674225Ⅱ-Ⅲ-Ⅲ945Tumor size (cm)7.3800.0071)≤1.21129>1.2775126Distant metastases0.4610.497Yes593722No291613T stage2.2470.523T1633T2603624T318135T4312TNM stage3.4380.329Ⅰ835Ⅱ392316Ⅲ28208Ⅳ1376

Note:AIM2.Absent in melanoma 2.1)P<0.05,the difference was statistically significant.

圖3 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的人膽管癌組織中AIM2的表達與預后的關系Fig.3 Relationship between AIM2 expression and prognosis in human CHOL tissues based on TCGA database

圖4 利用組織芯片隨訪數(shù)據(jù)分析AIM2表達對膽管癌患者總體生存率的影響Fig.4 Influence of AIM2 expression on overall survival rate of patients with cholangiocarcinoma with follow-up data of tissue microarray

表2 膽管癌患者總生存期影響因素Cox回歸分析

Tab.2 Cox regression analysis of factors influencing total survival of patients with cholangiocarcinoma

Clinical parametersUni-variateHR(95%CI)PMulti-variateHR(95%CI)PAIM2 expression level(high:low)0.293(0.130-0.662) 0.0021)0.320(0.120-0.853) 0.0231)Gender(male:female)1.511(0.662-0.712)0.2382.268(1.019-5.044) 0.0451)Age(years)(≤42:>42)0.167(0.068-0.408) 0.0001)0.180(0.070-0.465) 0.0001)Pathology classification(Ⅰ:Ⅱ:Ⅲ:Ⅳ)0.924(0.46-1.819)0.8181.222(0.594-2.514)0.586Tumor size (≤1.2 cm:>1.2 cm)3.038(1.008-9.152) 0.0481)1.162(0.320-4.219)0.820Distant metastases(yes:no)0.590(0.225-1.550)0.2840.821(0.248-2.723)0.748T stage(T1:T2:T3:T4)0.696(0.397-1.222)0.2070.917(0.363-2.317)0.855TNM stage(Ⅰ:Ⅱ:Ⅲ:Ⅳ)0.784(0.501-1.209)0.2710.927(0.465-1.849)0.830

Note:AIM2.Absent in melanoma 2；HR.Risk ratio；CI.Confidence interval.1)P<0.05，the difference was statistically significant.

3 討論

近年來，膽管癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內呈上升趨勢[6]。雖然在外科、化療和放療等方面取得了新進展，但膽管癌患者的預后仍然很差，5年生存率僅為5%～20%[7]。盡管完全性切除為膽管癌患者提供了最高的生存率，但準確的術前診斷仍然是最大的問題。AIM2基因共同存在于人和小鼠中，可作為DNA識別受體介導天然免疫應答，并且在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用[8]。近期研究表明，AIM2與感染防御和腫瘤病理相關，在不同腫瘤組織中異常表達[9,10]。但是目前AIM2在膽管癌中的臨床價值仍未得到明確的闡述，需進行實驗發(fā)現(xiàn)更多臨床依據(jù)對其進行驗證。

本研究通過免疫組化及組織芯片技術檢測人膽管癌組織及正常組織中AIM2的表達，結合臨床數(shù)據(jù)分析。結果表明，膽管癌組織中AIM2表達水平顯著低于正常組織，并且AIM2呈高表達的膽管癌患者的總存活率顯著優(yōu)于AIM2呈低表達水平的患者，這與最初提出的AIM2作為抑癌基因發(fā)揮腫瘤抑制作用結果一致[11]。Li等[12]研究表明，下咽鱗癌組織中的AIM2的表達水平明顯低于鄰近正常咽部組織(P<0.05)，且AIM2低表達水平與下咽鱗癌患者生存差密切相關(P<0.000 1)。同樣，Zhang等[13]觀察到AIM2正常結直腸組織中呈高表達，而在結直腸癌組織中的表達明顯較低(P<0.01)，與結直腸癌的預后不良相關，是結直腸癌患者總生存率的獨立預后因素，可作為結直腸癌潛在的診斷和預后生物標志物。武少賢等[14]研究亦表明AIM2表達在膽管癌組織中較正常組織降低。本實驗進一步評估了AIM2表達水平的臨床相關性，結果顯示，AIM2的表達水平與腫瘤大小明顯相關，與其他臨床病理特征均無顯著相關性，提示AIM2低表達可能與膽管癌的進展有關。Chai等[15]研究表明AIM2通過增強自噬的誘導作用來抑制腎癌的腫瘤進展，上調AIM2可能成為腎癌治療的新方法。另有研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)引起的AIM2缺失與肝癌患者不良預后相關，并通過觸發(fā)上皮-間質轉化(EMT)過程促進肝癌轉移，表明AIM2是乙型肝炎病毒相關性肝癌的潛在預后生物標志物，也是腫瘤轉移的可能治療靶標[16]。本實驗還通過單因素模型分析顯示，腫瘤較大的患者總生存期(OS)較腫瘤較小的患者OS顯著縮短，AIM2低表達的患者OS較AIM2高表達的患者OS顯著縮短。此外，多因素Cox風險比例模型顯示，患者AIM2表達水平、性別及年齡均可作為其預后預測的獨立危險因素。本研究除了具有重要的意義外，還存在一些潛在的局限性。例如，沒有通過進行體外研究在AIM2基因敲低或上調情況下的人源性膽管癌細胞增殖、殺傷以及遷移功能變化。因此， AIM2在CRC進展中的作用及其作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，AIM2在膽管癌進展中表達下調,可作為膽管癌患者預后的獨立危險因素，有望成為膽管癌診療的潛在靶點。但目前關于AIM2在膽管癌中分子作用機制的研究較少。因此，進一步研究AIM2在膽管癌進展中如何發(fā)揮作用具有重要的臨床意義。