王 添 陳新峰 張 震 張 毅 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心，鄭州 450052)

淋巴瘤是免疫系統(tǒng)的實(shí)體瘤，其中非霍奇金淋巴瘤(NHL)約占所有淋巴瘤病例的90%[1]。在近二十年中，雖然化療藥物、靶向藥物和自體造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展極大地改善了非霍奇金淋巴瘤患者的臨床療效。然而，仍有高達(dá)40%的患者在初次接受治療或治療一段時(shí)間后出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2]。因此，在目前的治療方式下，B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B cell-non-Hodgkin′s lymphoma，B-NHL)患者難以完全治愈，而復(fù)發(fā)難治(relapsed/refractory,R/R)B-NHL伴隨淋巴瘤細(xì)胞骨髓侵犯的患者預(yù)后更差。近年來，嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor-T cells，CAR-T)療法在淋巴瘤治療領(lǐng)域中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。CAR-T技術(shù)通過基因修飾使T淋巴細(xì)胞表達(dá)特定的CAR結(jié)構(gòu)域，可以特異性識別靶抗原、殺傷靶細(xì)胞[3]。CAR-T細(xì)胞具備針對特定腫瘤抗原的高度親和性，能高效殺傷表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞。CD19在不同分化階段的B淋巴細(xì)胞表面均有特異性表達(dá)，95%以上的B淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)CD19抗原,因此構(gòu)建抗 CD19 CAR-T細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)對B細(xì)胞腫瘤的治療目的。在治療復(fù)發(fā)難治性B細(xì)胞惡性腫瘤中，靶向CD19分子的CAR-T細(xì)胞療法已經(jīng)取得了較好的臨床療效[4]。骨髓是NHL常見的淋巴結(jié)外受累部位，對于確診時(shí)已有骨髓侵犯的患者，Ann Arbor分期即為Ⅳ期，多數(shù)患者腫瘤負(fù)荷較高且伴有明顯的淋巴結(jié)外侵犯，患者可出現(xiàn)進(jìn)行性貧血、血小板下降等表現(xiàn)，無論單因素或多因素分析均顯示骨髓侵犯是淋巴瘤患者的不良預(yù)后因素[5]。目前，關(guān)于應(yīng)用抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療伴隨骨髓侵犯的R/R B-NHL患者中的相關(guān)文獻(xiàn)尚少[6]，且CAR-T細(xì)胞在治療后骨髓中的維持復(fù)制能力也鮮有報(bào)道。本文我們將我院應(yīng)用抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療的5例骨髓侵犯的R/R B-NHL患者的療效以及不良反應(yīng)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料 選取2017年11月至 2018年5月在我院接受CD19 CAR-T細(xì)胞治療的R/R B-NHL患者(NCT03156101)共5例，患者臨床特征詳見表1。其中男4例，女1例，中位年齡54(18～60)歲。原發(fā)疾病全部為B-NHL，其中濾泡型淋巴瘤(follicular lymphoma，F(xiàn)L)1例，套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)1例，淋巴母細(xì)胞淋巴瘤(lymphoblastic lymphoma，LBL)1例，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)1例，高級別B細(xì)胞淋巴瘤(high-grade B-cell lymphoma，HGBCL)1例。入組時(shí)腫瘤負(fù)荷為高負(fù)荷4例，低負(fù)荷1例。所有患者在入組之前均接受過化療，接受CAR-T回輸治療前的疾病狀態(tài)為復(fù)發(fā)難治及MRD+。所有患者均經(jīng)骨髓活檢及骨髓細(xì)胞流式證實(shí)骨髓中有CD19+的異常B細(xì)胞侵犯，并通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)證實(shí)了淋巴瘤組織上的CD19表達(dá)。主要的排除指標(biāo)是活動性感染和血細(xì)胞減少(淋巴細(xì)胞絕對值<0.8×109L)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會審批通過，入組患者對于臨床研究內(nèi)容完全知情，并簽署知情同意書。

1.2CAR-T細(xì)胞治療方案 在回輸前第14天，采集5例患者的自體外周血淋巴細(xì)胞并進(jìn)行基因修飾。將帶有CD19單鏈可變區(qū)(single chain fragment variable，scFv)、人4-1BB共刺激域和CD3ζ信號域的CAR-T19-4-1BB載體克隆到慢病毒骨架中。收集，純化和濃縮慢病毒上清液。采用密度梯度離心法及磁分選方法分離并應(yīng)用anti CD3/CD28活化微珠激活患者的CD3+T細(xì)胞。然后將細(xì)胞在含有5 ng/ml IL-7和5 ng/ml IL-15的X-VIVO 15培養(yǎng)基(Lonza)中培養(yǎng)，并在24～48 h內(nèi)用濃縮的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后培養(yǎng)10 d。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，使用流式細(xì)胞儀(BD)采用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)評估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(轉(zhuǎn)染率40%～70%)。在回輸前對患者采用FC方案(氟達(dá)拉濱25 mg/m2×3 d，環(huán)磷酰胺250 mg/m2×3 d)進(jìn)行預(yù)處理，并分3次進(jìn)行CD19 CAR-T細(xì)胞回輸治療(第0天10%，第1天30%，第2天60%)，輸注CAR-T細(xì)胞總數(shù)為0.62(0.39～1.30)×106個(gè)/kg(圖1)。

1.3療效及不良反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn) CAR-T細(xì)胞輸注后第28天時(shí)進(jìn)行近期療效評估，評估依據(jù)NCCN指南進(jìn)行。根據(jù)《2017國際工作組共識:淋巴瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》(RECIL 2017)將患者的療效評價(jià)為：CR、PR、SD和PD[7]。根據(jù)針對NHL的Lugano反應(yīng)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[8]，使用CT或PET-CT評估患者的疾病改變。根據(jù)至少滿足一項(xiàng)Group d′Etude des Lymphoma Folliculaires criteria評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來定義高腫瘤負(fù)擔(dān)[9]。CRS診斷標(biāo)準(zhǔn)參考Lee等[10]提出的標(biāo)準(zhǔn)，分為4級。

1.4隨訪 對招募的所有接受CD19 CAR-T細(xì)胞治療的患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為2017年8月12日至2019年9月30日。中位隨訪時(shí)間為18(12～19)個(gè)月。

2 結(jié)果

2.1臨床特征 共有5例患者接受了抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療，患者臨床特征詳見表1。5例患者均為血液學(xué)全面復(fù)發(fā)，且在入組時(shí)均被診斷為淋巴瘤骨髓侵犯。4例B-NHL患者行多輪(5～18輪)化療后復(fù)發(fā)，其中3號患者因在接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案后得到持續(xù)4年的CR后LBL復(fù)發(fā)，入組前未接受化療。

2.2CAR-T療效 5例患者輸注CAR-T細(xì)胞后，檢測CAR-T細(xì)胞在外周血中占CD3+T細(xì)胞的比例及達(dá)峰時(shí)間，詳見圖1。全部患者外周血中均能檢測到CAR-T細(xì)胞，中位達(dá)峰時(shí)間為治療后第14(9～28)天，其中，5號患者在回輸后第4天出現(xiàn)CAR-T細(xì)胞一過性的下降(6.06%)，隨后幾天內(nèi)上升。外周血流式結(jié)果顯示，回輸前患者的外周血CD45+淋巴細(xì)胞中，CD19+B細(xì)胞所占的中位百分比為4.3%(0.5%～53.6%)，而CD3+T細(xì)胞占82.9%(36.0%～86.8%)。詳見圖2，回輸CD19 CAR-T細(xì)胞后的第14天，在外周血中均未檢測到正?；驉盒缘腃D19+B細(xì)胞，而CD3+T細(xì)胞占84.1%(63.3%～98.8%)，骨髓活檢顯示5例患者均未檢測到骨髓侵犯。所有患者均在接受抗CD19 CAR-T細(xì)胞輸注后30 d進(jìn)行療效評估，4例(80.0%)達(dá)CR，1例(20.0%)達(dá)PR，總CR率為80.0%(4/5)，見表1。

表1 5例接受抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療患者的臨床特征

Tab.1 Clinical characteristics of 5 patients receiving anti-CD19 CAR-T cell therapy

No.SexAge(years)SubtypeTumor burdenNo.of priortherapiesCAR-Tdose(106 kg-1)Relapse aftertreatmentBone marrow involvementafter treatmentResponse1Male55FLLow161.30nonoCR(18 month)2Male54MCLHigh180.47nonoCR(19 month)3Male18LBLHigh01)0.63nonoCR(16 month)4Male60DLBCLHigh60.62nonoPR(12 month)5Female25HGBCLHigh50.39nonoCR(19 month)

Note:Patient 01)received CR for 4 years after a standard chemotherapy regimen,and relapsed with B-LBL who enrolled onto this study without any chemotherapy.

表2 患者CRS的臨床表現(xiàn)

Tab.2 Clinical manifestations of CRS in patients

No.CRS levelClinical features1ⅡAnemia,thrombocytopenia,hypoglobulinemia,elevated transaminase level,myalgia,hypertension2ⅡFever,anemia,neutropenia,hypoglobulinemia,infection,tachycardia,hypertension3ⅡFever,anemia,hypoxemia,thrombocytopenia,elevated transaminase,anorexia,vomiting,tachycardia,hyper-tension,bone marrow suppression4ⅡFever,anemia,pain,hypertension5ⅣFever,grade 4 neutropenia,grade 4 thrombocytopenia,hypoxemia,pain,elevated transaminase,rash,hypoten-sion,prolonged prothrombin time

圖1 患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增情況Fig.1 CAR-T amplification in patients

圖2 患者外周血內(nèi)CD3+T細(xì)胞及CD19+B細(xì)胞的比例變化Fig.2 In vivo expansion and persistence of CD3+T cells and CD19+B cells

2.3CRS 5例患者均發(fā)生CRS，其中2級4例，4級1例(表2)。4例患者出現(xiàn)發(fā)熱，開始于回輸后第1、2天，持續(xù)約1周，14 d內(nèi)體溫均恢復(fù)正常。其中，5號患者在第6日出現(xiàn)持續(xù)性高熱，給予托珠單抗(160 mg) 注射液治療后恢復(fù)正常。4例患者出現(xiàn)貧血；2例患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高；5號患者發(fā)生4級CRS，出現(xiàn)高熱、血壓降低、凝血異常、缺氧和腹痛，應(yīng)用嗎啡對癥治療、IL-6抗體及糖皮質(zhì)激素治療后好轉(zhuǎn)；因其出現(xiàn)4級骨髓抑制，應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子、重組人血小板生成素、血小板、輻照懸浮紅細(xì)胞、冷凍血漿和抗生素進(jìn)行對癥治療后得到好轉(zhuǎn)。

2.4長期隨訪及無病生存情況 對所有患者隨訪1年以上，中位隨訪時(shí)間18(12～19) 個(gè)月。4例患者在CAR-T細(xì)胞輸注后獲得CR，1例患者獲得PR。隨訪結(jié)束時(shí)，5例患者無復(fù)發(fā)，無淋巴瘤骨髓侵犯。

3 討論

經(jīng)歷多輪化療后伴有淋巴瘤骨髓侵犯的B-NHL復(fù)發(fā)患者僅依靠化療很難獲得CR，且疾病再次復(fù)發(fā)率高，難以獲得長期存活[11]，因此，該類患者迫切需要新的治療方法。近年來，針對特異性腫瘤抗原的CAR-T細(xì)胞免疫療法在治療B細(xì)胞淋巴瘤中展現(xiàn)出較好的治療效果，對降低患者死亡率有重要意義[12]。靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)展現(xiàn)出強(qiáng)大的清除CD19+B淋巴細(xì)胞的能力，因此有望成為B細(xì)胞惡性腫瘤的治療方法[13]。目前，對于CAR-T細(xì)胞治療NHL的安全性及有效性也已得到證實(shí)[13]。但關(guān)于CAR-T細(xì)胞治療多輪化療后復(fù)發(fā)伴隨骨髓侵犯患者遠(yuǎn)期臨床療效的研究尚無大量報(bào)道，本研究中納入了具有不同亞型的B-NHL患者，5例患者在入組時(shí)均呈現(xiàn)血液學(xué)復(fù)發(fā)狀態(tài)，且伴隨淋巴瘤骨髓侵犯，患者應(yīng)用抗CD19 CAR-T細(xì)胞輸注治療后進(jìn)行療效及不良反應(yīng)評價(jià)并隨訪1年以上，4例患者評價(jià)為CR，1例患者評價(jià)為SD-PR，CR率為4/5(80.0%)，尚無復(fù)發(fā)情況。雖然本報(bào)道病例數(shù)少，但初步結(jié)果好于其他一些報(bào)道[4,13]。

應(yīng)用CAR-T細(xì)胞治療最常見的不良反應(yīng)是CRS[14]，CRS臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、缺氧、低血壓等癥狀，有較少患者會出現(xiàn)多器官衰竭或淋巴細(xì)胞增多等癥狀[10]。CAR-T細(xì)胞與其靶抗原結(jié)合后導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞活化并大量釋放細(xì)胞因子，釋放的促炎因子過多則會導(dǎo)致CRS相關(guān)的臨床癥狀[9]。據(jù)報(bào)道，CD19 CAR-T細(xì)胞治療后，分別有13%和28%的B細(xì)胞淋巴瘤患者發(fā)生3級或更高的CRS和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[15]。本研究在4/5(80.0%)的患者中觀察到1～2級CRS，僅有1/5(20.0%)的患者發(fā)生4級CRS。5號患者發(fā)生4級CRS可能與其腫瘤負(fù)荷高有關(guān)，在給予托珠單抗和糖皮質(zhì)激素治療后得到成功控制。提示應(yīng)用CAR-T細(xì)胞治療時(shí)，4級CRS發(fā)生率低且患者可耐受、癥狀可處理。

B-NHL患者應(yīng)用CAR-T細(xì)胞治療后仍存在疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，其主要原因可能是 CAR-T細(xì)胞進(jìn)入人體后增殖水平差，維持時(shí)間較短。Park等[16]隨訪報(bào)道了53例B-ALL復(fù)發(fā)患者應(yīng)用CAR-T 細(xì)胞治療的病例，結(jié)果表明應(yīng)用CAR-T細(xì)胞治療后患者的生存期可能與CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間無關(guān)，而與回輸CAR-T細(xì)胞前患者的疾病狀態(tài)和腫瘤負(fù)荷有關(guān)。本研究中納入了4例高腫瘤負(fù)荷的復(fù)發(fā)患者，在應(yīng)用CAR-T細(xì)胞治療后有3例獲得CR，1例獲得PR，提示CD19 CAR-T細(xì)胞治療對于高腫瘤負(fù)荷患者也有較好的療效。本研究5例患者均接受了自體T細(xì)胞改造的CAR-T細(xì)胞回輸，無移植物抗宿主現(xiàn)象，這可能與CAR-T細(xì)胞療效提升以及CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)維持長期療效有關(guān)[17]。

綜上所述，應(yīng)用CD19 CAR-T細(xì)胞治療多輪化療后復(fù)發(fā)伴隨骨髓侵犯B-NHL患者，隨訪1年以上，療效及安全性較令人滿意，對淋巴瘤的長期控制療效良好，且能有效緩解骨髓侵犯，重度CRS發(fā)生率較低，且相關(guān)不良反應(yīng)也能通過治療得到控制?？梢哉J(rèn)為在多輪化療后復(fù)發(fā)伴骨髓侵犯的B-NHL患者中應(yīng)用CD19 CAR-T細(xì)胞治療是一種有前途的治療策略。但是本研究涉及病例數(shù)少，有待增加病例做進(jìn)一步的驗(yàn)證。