周穎 羅婷 袁韻 龔玉萍

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是成人最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，約占NHL的30%～40%[1]。目前，R-CHOP是DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，治愈率可達(dá)到60%[2]。盡管R-CHOP的成功治療效果有所改善，但復(fù)發(fā)和難治性疾病的患者仍是該疾病治療的一大挑戰(zhàn)。近年來，高通量技術(shù)揭示了DLBCL基因改變的更復(fù)雜特征，并發(fā)現(xiàn)了新的治療途徑。DLBCL靶向治療的候選通路之一是STAT3通路[3]。STAT3在包括血淋巴樣惡性腫瘤在內(nèi)的許多癌癥中被活化[4]。STAT3激活， 活化的STAT3(phospho-STAT3,p-STAT3)進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、增殖[5]。免疫組化檢測到的STAT3或p-STAT3單獨(dú)表達(dá)是所有DLBCL患者的不良預(yù)后因子[6]。S1pr1是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)G蛋白偶聯(lián)受體的成員，通過調(diào)控ERK、Akt和Rac通路分別引起細(xì)胞增殖和遷移等多種生物學(xué)效應(yīng)[7]。最近有據(jù)報(bào)道顯示，S1pr1也轉(zhuǎn)錄p-STAT3和增強(qiáng)S1pr1隨后地激活STAT3，建立一個(gè)積極的反饋回路，包括S1pr1/p-STAT3途徑，這對于小鼠和人實(shí)體瘤以及腫瘤相關(guān)骨髓細(xì)胞STAT3的持續(xù)激活至關(guān)重要[8]?；羝娼鹆馨土?HL)和NHL在細(xì)胞系或組織中均有S1pr1的表達(dá)，提示S1pr1在這種情況下具有潛在的生物學(xué)作用[9]。然而，S1pr1在DLBCL患者中的預(yù)后研究鮮有報(bào)道。本研究通過沉默OCI-LY1細(xì)胞中S1pr1基因的表達(dá)，觀察OCI-LY1細(xì)胞增殖和遷移情況，并初步探討其可能的機(jī)制，為 DLBCL 的治療提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器 人DLBCL OCI-LY1細(xì)胞 (中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫)；S1pr1特異性siRNA和陰性對照(negative control，NC)(上海吉瑪生物科技有限公司)；DMEM 培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清(美國Gibco公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)(美國Amresco公司)；人淋巴細(xì)胞分離液(上海博升生物科技有限公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)；PCR引物序列設(shè)計(jì)和合成(大連TaKaRa公司)，引物編號：S1pr1(002215-PN4426784)、β-actin(001973-PN4427975)；細(xì)胞蛋白抽提試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)；鼠抗S1pr1、STAT3、p-STAT3(美國Santa Cruz公司)；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Westen blot試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Ther-mo Revco)；HBS-1096B 酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Transwell小室(CORNING科技有限公司，美國)；基質(zhì)膠、凝膠成像儀(美國UVP 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)；BIO-RAD垂直電泳儀(美國BD公司)；NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)。

1.2 標(biāo)本來源 收集我院確診為DLBCL的患者10例，同時(shí)選擇10例健康者外周血，利用淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入1 ml Trizol，-80℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試對象均簽署知情同意書，嚴(yán)格按照《赫爾辛基宣言》執(zhí)行。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)OCI-LY1細(xì)胞，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、陰性對照組和S1pr1沉默組。空白對照組在鋪板后72 h收獲細(xì)胞，陰性對照組和S1pr1沉默組分別用Lipofectamine法將陰性對照(negative control，NC)和S1pr1特異性siRNA轉(zhuǎn)染到OCI-LY1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按照1.3方法處理細(xì)胞，消化后以5×103/孔接種于96孔板中，200 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，向培養(yǎng)板中加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀在630 nm處測定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，每組設(shè)3個(gè)平行孔。

1.5 細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn) 按照1.3方法處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用不含血清培養(yǎng)基的重懸，調(diào)整濃度為2×105后接種在24孔Transwell小室中，每孔100 μl，下室加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，棄上室培養(yǎng)基，用無菌棉簽擦拭去除上室內(nèi)的細(xì)胞，進(jìn)行固定，用結(jié)晶紫染色30 min，沖洗干凈后顯微鏡下觀察細(xì)胞，拍照。計(jì)數(shù)紫色染色的穿膜細(xì)胞，即細(xì)胞遷移能力，每組設(shè)3個(gè)平行孔。

1.6 RT-PCR檢測S1pr1 mRNA表達(dá) 取保存的外周血標(biāo)本和按照1.3方法處理細(xì)胞，根據(jù)Trizol提取試劑盒操作說明書進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，制備20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95℃ 30 s，93℃ 10 s，60℃ 3 s，40個(gè)循環(huán)，60℃時(shí)采集熒光，以β-actin作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算S1pr1表達(dá)量。

1.7 Western Blot法檢測S1pr1、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平 按照1.3方法處理細(xì)胞，消化后5 000 r/min、5 min離心，洗滌2次，加入1 μl PMSF，根據(jù)細(xì)胞量加入胞蛋白抽提試液，冰浴2 h；4℃、10 000 r/min、15 min，取上清，進(jìn)行蛋白定量；進(jìn)行電泳、切膠；孵育一抗、孵育二抗，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL患者及健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞中S1pr1 mRNA的表達(dá) DLBCL患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中S1pr1 mRNA相對中位表達(dá)水平為13.02(0.54～31.28)，高于健康者的0.74(0.07～5.67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞S1pr1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，陰性對照組OCI-LY1細(xì)胞中S1pr1 mRNA和蛋白表達(dá)變化不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；S1pr1沉默組OCI-LY1細(xì)胞中S1pr1 mRNA和蛋白表達(dá)較空白對照組和陰性對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖1。

表1 DLBCL患者及健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞中S1pr1 mRNA的表達(dá) n=10

注：與健康者比較，*P<0.05

表2 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞S1pr1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

圖1 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞S1pr1蛋白表達(dá)的影響；A.空白對照組；B.陰性對照組；C.S1pr1沉默組

2.3 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞增殖和遷移的影響 與空白對照組比較，陰性對照組OCI-LY1細(xì)胞增殖率和遷移細(xì)胞數(shù)變化不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；S1pr1沉默組OCI-LY1細(xì)胞增殖率和遷移細(xì)胞數(shù)較空白對照組和陰性對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞增殖和遷移的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

ABC

圖2 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞遷移的影響(×200);A.空白對照組；B.陰性對照組；C.S1pr1沉默組

2.4 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，陰性對照組OCI-LY1細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)變化不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；S1pr1沉默組OCI-LY1細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)較空白對照組和陰性對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4,圖3。

表4 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

圖3 S1pr1沉默對OCI-LY1細(xì)胞STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響;A.空白對照組；B.陰性對照組；C.S1pr1沉默組

3 討論

近十年來，基因干預(yù)已成為癌癥生物學(xué)研究的熱點(diǎn)分子，許多目標(biāo)基因在腫瘤發(fā)生和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著重要作用?？茖W(xué)家們開始主張通過基因靶向干預(yù)，以此作為治療各種惡性腫瘤的新靶點(diǎn)。STAT3在不同的腫瘤中被活化，但其在DLBCL中的作用尚不清楚。盡管STAT3是一個(gè)很有前景的癌癥治療靶點(diǎn)，但由于其細(xì)胞內(nèi)定位和缺乏酶活性，有效抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[10]。

最近，一種G蛋白偶聯(lián)受體S1pr1被發(fā)現(xiàn)對某些小鼠腫瘤和人類腫瘤細(xì)胞中STAT3的持續(xù)激活非常重要。S1pr1可與JAK2發(fā)生物理作用，導(dǎo)致STAT3磷酸化增加，p-STAT3可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)S1pr1的表達(dá)，形成前饋循環(huán)[11]。STAT3的活化也受白細(xì)胞介素6(IL-6)等因素的影響，進(jìn)一步導(dǎo)致S1pr1過表達(dá)[12]。與STAT3相比，S1pr1具有更有利的細(xì)胞定位和酶標(biāo)靶能力。然而，S1pr1在癌癥生物學(xué)中的重要性才剛剛開始被認(rèn)識(shí)，其作為人類癌癥治療靶點(diǎn)的潛在重要性還有待進(jìn)一步評估。在本研究中，我們關(guān)注的是S1pr1在DLBCL中的表達(dá)和功能。

S1pr1對T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞保留在次生淋巴器官中起著至關(guān)重要的作用。S1pr1在內(nèi)皮細(xì)胞中也有高表達(dá)，這些細(xì)胞中S1pr1的表達(dá)對腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移具有重要意義[13]。另一方面，阻斷S1pr1可使淋巴瘤細(xì)胞保留在淋巴器官中，這是由于S1pr1存在功能缺陷，這可能會(huì)限制淋巴瘤細(xì)胞的侵襲潛能[14]。S1pr1信號可以被一種有效的抑制劑FTY720阻斷，F(xiàn)TY720是一種免疫抑制劑，目前正被用于治療多發(fā)性硬化癥[15]。除了靶向該通路的藥物FTY720外，S1P配體抗體也被證明可以有效抑制多種小鼠模型的原發(fā)性腫瘤生長，近期已進(jìn)入其他適應(yīng)癥的臨床試驗(yàn)[16]。由于已知S1P/S1pr1信號通路與多個(gè)重要通路相關(guān)，包括T細(xì)胞中的mTOR通路和非淋巴細(xì)胞中的Akt通路，因此，S1pr1通過STAT3信號通路以外的機(jī)制在DLBCLs生物學(xué)中的可能作用尚待闡明[17]。另一種可能是使用一種新的體內(nèi)siRNA干擾技術(shù)，利用S1pr1 siRNA不僅可以靶向抑制腫瘤細(xì)胞中的S1pr1/STAT3信號，還可以通過激活腫瘤相關(guān)的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，同時(shí)增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答[18]。將STAT3與S1pr1共定位于ABC DLBCL組織的腫瘤細(xì)胞中，通過S1pr1 siRNA抑制S1pr1成功抑制了STAT3的活性和腫瘤細(xì)胞的生長。在目前DLBCL患者的臨床的研究中發(fā)現(xiàn)，S1P/S1pr1通路的激活導(dǎo)致DLBCL病情的惡化，因此，除了STAT3，S1P被認(rèn)為是一個(gè)有前途的目的蛋白[19]。有趣的是，最近的一項(xiàng)研究顯示，S1pr1/STAT3信號通路是慢性腸道炎性和結(jié)腸炎相關(guān)癌癥之間的重要聯(lián)系?？紤]到S1pr1/STAT3通路在炎性反應(yīng)和炎性相關(guān)癌變中的重要作用，提示S1pr1/STAT3通路可能參與炎性易發(fā)區(qū)域的淋巴生成[20]。本研究結(jié)果顯示，通過沉默S1pr1基因，降低了STAT3和p-STAT3的水平，同時(shí)導(dǎo)致OCI-LY1細(xì)胞增殖和遷移能力被抑制。

綜上所述，沉默OCI-LY3細(xì)胞S1pr1基因可調(diào)節(jié)STAT3的活性水平，抑制OCI-LY3細(xì)胞增殖能力，降低OCI-LY3細(xì)胞的遷移能力，為DLBCL的治療提供了一個(gè)新的靶標(biāo)。然而，我們還需要進(jìn)一步闡明S1pr1功能在DLBCL治療中的具體機(jī)制，以驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。