楊宋玲 張慶平 曾秋玲 寧景春

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在內(nèi)皮細胞維持中發(fā)揮重要作用，參與內(nèi)皮化和新生血管的形成[1]。EPCs的這一優(yōu)點對以缺血組織再生為目標的細胞治療具有吸引力，體外擴張EPC可能有助于缺血性疾病的潛在臨床細胞治療。靜脈注射自體EPCs是可行和安全的，并可能對特發(fā)性肺動脈高壓成人的運動能力和肺血流動力學有有益的影響[2,3]。雖然這些研究為臨床應用EPCs提供了各種見解，但潛在的細胞治療方法的一個主要限制是循環(huán)血液中EPCs的數(shù)量有限(<白細胞的0.05%)[4]。因此，體外擴增EPCs是必要的。然而，EPCs的體外培養(yǎng)導致EPC衰老的迅速開始，從而嚴重限制了EPCs的增殖能力和克隆擴增潛力[5]。因此，關于潛在的細胞治療方法，一個重要的問題是體外擴張引起的EPCs衰老是否可以通過藥物、細胞因子治療來延遲[6,7]。大多數(shù)抗癲癇藥物在臨床應用中的作用機制尚不完全清楚。抗癲癇藥物可改變多種生理機制[8]。丙戊酸延遲EPCs衰老的發(fā)生，這可能與PI3K/Akt通路有關，我們研究了EPCs衰老和增殖的調(diào)控[9]。丙戊酸的劑量和時間可以顯著增加EPCs的數(shù)量和活性，所以我們進一步闡明丙戊酸對EPC衰老的潛在作用。VM是高侵襲性腫瘤細胞模擬血管內(nèi)皮細胞ECs形成高度排列的管狀通道，這些通道發(fā)揮血管的功能，內(nèi)壁完全由腫瘤細胞構成，不含ECs[9]。VM是一個多步驟的過程，包括腫瘤細胞的活化、增殖、腫瘤細胞向內(nèi)皮樣細胞分化和生成新的功能血管[10]。然而VM背后的許多機制仍然不清楚。因此我們研究抗癲癇藥丙戊酸影響EPCs衰老和血管擬態(tài)的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 循環(huán)EPC的分離與培養(yǎng):用Ficoll密度梯度離心法從健康志愿者的外周血中分離出單核細胞(MNCs)，并在199σ培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中加入10%胎牛血清和VEGF(50 ng/ml,Chemicon)。在激光掃描聚焦顯微鏡下，EPCs表現(xiàn)為黏附細胞雙陽性，可吸收dildl并結(jié)合凝集素。通過流式細胞術顯示KDR、CD34和AC133的表達，進一步證明了它們的存在。醫(yī)學倫理學問題:所有實驗程序經(jīng)醫(yī)學和健康研究倫理委員會批準，參與者在入組前均提供書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 菌落分析:培養(yǎng)4 d后，用EDTA輕輕分離粘附細胞。用100 ng/ml人重組VEGF將細胞(1×105)接種于甲基纖維素板中。平板在顯微鏡下進行研究，培養(yǎng)10 d后由兩名獨立研究者對菌落進行計數(shù)。

1.2.2 EPCs增殖試驗:通過加入5-溴-2-脫氧尿苷(brdu)來評估EPC的增殖。細胞(1×104細胞/孔)在96孔塑料板中培養(yǎng)。將Brdu(10 μm)添加到培養(yǎng)基和細胞再培養(yǎng)18 h。根據(jù)說明書，用細胞增殖酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)測定BrdU摻入量。

1.2.3 增殖活性測定:用比色法3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基氧基苯酚-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)分析測定有絲分裂活性。在每4小時加入丙戊酸進入EPCs后，培養(yǎng)14 d后收獲EPCs，再在96個孔板(110個4個細胞)中接種0.1 ml EBM-2培養(yǎng)基，在重組人VEGF的存在下添加0.5%牛血清白蛋白(100 ng/ml；明尼阿波利斯，明尼蘇達，美國)。培養(yǎng)24 h后，將MTS甲硫酸氫鈉溶液添加到每個孔中3 h，并使用酶聯(lián)免疫吸附測定板(美國馬里蘭州肯辛頓生物技術實驗室)檢測490 nm處的光吸收率。

1.2.4 衰老相關β-半乳糖苷酶活性測定:用β-半乳糖苷酶染色試劑盒(biovision)測定衰老相關β-半乳糖苷酶(sa-b-gal)活性。在PBS中清洗EPC，在室溫下用0.5 ml固定液固定10～15 min，在37℃下用染色液混合物清洗和培養(yǎng)過夜。在顯微鏡下觀察細胞是否出現(xiàn)藍色(200倍總放大倍數(shù))。

1.2.5 西方墨點法:采用丙戊酸治療EPC 24 h。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上制備和分離細胞蛋白，分離后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Amersham)。在含有0.1%(v/v)吐溫20和5%(v/v)非脂肪干乳的Tris緩沖鹽水(pH值7.5)中培養(yǎng)2 h，然后在室溫下用多克隆抗磷酸Akt-Ser 473或抗Akt抗體(細胞信號技術)培養(yǎng)2 h，阻斷細胞膜。過濾器在含有0.1%(v/v)吐溫20的三緩沖鹽水中廣泛清洗，然后與過氧化物酶結(jié)合的二級抗阿巴特抗體培養(yǎng)1 h。然后使用EZ-ECL檢測試劑盒(生物工業(yè))沖洗。

1.2.6 熒光染料注射:通過靜脈注射熒光染料證明VM，熒光團結(jié)合的凝集素與GFAP+膠質(zhì)母細胞瘤細胞共定位，多普勒成像觀察注射微泡，PI3K通路激活膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1。

1.2.7 培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長因子蛋白的測定:為了評估血管內(nèi)皮生長因子蛋白的分泌，在第14天使用丙戊酸治療的EPC(1×106)被切換到無生長因子培養(yǎng)基EBM-2，用5%胎牛血清培養(yǎng)72 h。根據(jù)說明書，使用市售的血管內(nèi)皮生長因子夾心免疫分析(R&D系統(tǒng))測量細胞培養(yǎng)基中的血管內(nèi)皮生長因子蛋白。檢測系統(tǒng)與血小板源性生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子無交叉反應。

2 結(jié)果

2.1 丙戊酸阻止EPCs衰老 EPCs的培養(yǎng)導致SA-B-gal陽性細胞增加，與丙戊酸共培養(yǎng)可顯著改變SA-B-gal陽性細胞，EPCs衰老的抑制作用與丙戊酸呈劑量依賴性差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 丙戊酸對EPCs增殖的影響 BrdU摻入試驗表明，丙戊酸處理的EPCs的有絲分裂潛能超過未處理(對照組)EPCs，這一效應與劑量有關(P<0.05)。見表2。

2.3 丙戊酸對EPCs克隆擴增的影響 在丙戊酸存在或不存在的情況下，將1×105EPCs接種于甲基纖維素平板中。經(jīng)過丙戊酸預處理的EPCs菌落數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05)。見表3。

表1 丙戊酸影響EPCS衰老結(jié)果

表2 丙戊酸對EPCs增殖的影響

表3 丙戊酸對EPCs克隆擴增的影響

2.4 丙戊酸對血管內(nèi)皮生長因子分泌的影響 在72 h內(nèi)，丙戊酸處理的EPC培養(yǎng)基VEGF濃度明顯高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 丙戊酸對VEGF濃度的影響

2.5 丙戊酸通過PI3K/Akt通路誘導端粒酶活性 PI3K/Akt通路參與了丙戊酸誘導酶的激活。EPCs在與丙戊酸培養(yǎng)前，先用磷脂酰諾西醇3激酶(PI3K)阻滯劑wortmannin或LY294002預處理，然后評估酶的活性。無論是wortmannin還是LY294002都能明顯減弱丙戊酸對酶活性的增加。接下來我們研究丙戊酸是否會誘導Akt磷酸化，用不同丙戊酸刺激EPCs 24 h，用anti-phospho-Akt或anti-Akt antibody免疫印跡。丙戊酸刺激引起劑量依賴Akt的磷酸化，但并不影響Akt的總量。見表5。

表5 丙戊酸對EPCs酶活性的影響

2.6 丙戊酸激活PI3K通路 通過脈注射熒光染料發(fā)現(xiàn)丙戊酸通過PI3K通路激活膜型基質(zhì)金屬蛋白-1，膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1能夠激活MMP-2的蛋白水解作用，從而影響VM。見圖1。

圖1 熒光染料染色圖 PI3K通路也對應于VM的基底板連續(xù)切片雙染色，驗證丙戊酸通過PI3K通路激活膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1

3 討論

腫瘤細胞形成毛細血管樣結(jié)構可能需要凋亡細胞死亡來清除不包括在血管網(wǎng)中的多余細胞，而血管網(wǎng)沒有開啟導致腫瘤細胞向內(nèi)皮樣細胞分化的基因程序[11]。細胞衰老被廣泛認為是一種末梢生長停滯的一般生理過程，可由有限數(shù)量的細胞分裂觸發(fā)[12]。衰老細胞雖然不增殖，但其代謝和綜合活性保持不變，其形態(tài)發(fā)生特征性變化，細胞形態(tài)變大、變平，胞質(zhì)形態(tài)呈空泡狀，顆粒度呈增大的[13]。衰老被認為是正常細胞中必不可少的抗癌程序，與凋亡類似，衰老也能干擾腫瘤生長。SA-B gal可以反映衰老細胞溶酶體重的增加，其表達被廣泛用作細胞衰老的可靠指標[14]。一些腫瘤細胞為了促進VM結(jié)構的形成而激活凋亡和衰老。此外，衰老細胞還產(chǎn)生許多影響其他腫瘤細胞生長的因子，這些因子可能影響VM的形成?？梢娝ダ蠀⑴cVM的形成。丙戊酸能夠阻止EPCs的衰老，而EPCs的衰老與高增殖能力和顯著增加的克隆擴增有關[15]。EPCs是由外周血單個核細胞產(chǎn)生的，為了評估衰老，檢測酸性b-半乳糖苷酶作為細胞衰老的生化標記物。EPCs的培養(yǎng)導致SA-B-gal陽性細胞的增加。與丙戊酸共培養(yǎng)可顯著抑制SA-B-gal陽性細胞的增加。EPCs衰老的抑制作用呈劑量依賴性。BrdU摻入試驗表明，丙戊酸能促進細胞增殖。

證明丙戊酸延緩衰老的發(fā)生后，我們研究了這種作用是否轉(zhuǎn)化為增殖活性和血管內(nèi)皮生長因子分泌的增加。血管內(nèi)皮生長因子的分泌作為一種機制，可能有助于它們的促血管生成作用。MTS分析表明，丙戊酸處理的EPC的有絲分裂潛能超過了未處理EPC的有絲分裂潛能，丙戊酸處理的EPC的培養(yǎng)基中的VEGF濃度明顯高于未處理的EPC。

Akt在調(diào)節(jié)細胞衰老方面發(fā)揮重要作用。此外，PI3K/Akt通路在阿托伐他汀介導的EPCs衰老預防中發(fā)揮重要作用[16]。我們檢驗了PI3K/Akt通路參與了丙戊酸誘導的激活。EPCs在與丙戊酸培養(yǎng)前，先用磷脂酰諾西醇3激酶(PI3K)阻滯劑wortmannin或LY294002預處理，然后評估其酶活性。無論是wortmannin還是LY294002都能明顯減弱丙戊酸對酶活性的增加。丙戊酸誘導Akt磷酸化，Akt是PI3K的下游效應因子。用不同丙戊酸刺激EPCs 24 h，用免疫印跡法，丙戊酸刺激引起劑量依賴Akt的磷酸化，但并不影響Akt的總量。我們發(fā)現(xiàn)丙戊酸顯著增加了Akt磷酸化。絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，也被稱為蛋白激酶B，通過在人臍帶內(nèi)皮細胞和黑色素瘤細胞中磷酸化叔丁基化來增強酶活性。除了叔丁酸的直接磷酸化，Akt也可能通過增加內(nèi)皮一氧化氮合酶(enos)的活性，因為已經(jīng)證明一氧化氮能延緩內(nèi)皮細胞衰老。然而，非供體亞硝基異戊胺(SNAP)并不能阻止EPC的衰老和抑制NO合成酶的表達。G-單甲基-L-精氨酸(LNMA)沒有加速EPC衰老的發(fā)生，這表明EPC衰老的調(diào)節(jié)獨立于NO。數(shù)據(jù)表明丙戊酸增加了EPC中的Akt磷酸化，這可能導致叔丁酸的磷酸化增加。叔丁酸磷酸化的增加可能增強酶活性，從而阻止EPC的衰老。

丙戊酸通過PI3K通路激活膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1，在VM的發(fā)生中起重要作用。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1能夠激活MMP-2的蛋白水解作用，后者將LN-5γ2鏈水解后形成的片段有助于VM發(fā)生過程中腫瘤細胞的遷移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明丙戊酸通過激活酶和Akt磷酸化延緩EPCs衰老的發(fā)生。丙戊酸對EPCs衰老的抑制作用和體外誘導EPCs增殖可能提高EPCs的功能活性，對潛在的細胞治療具有重要意義。丙戊酸通過PI3K通路斷拮抗VM的發(fā)生。