曾斌 黃云川 曹曉磊 茍林

骨肉瘤(osteosarcoma)是原發(fā)惡性骨腫瘤，主要發(fā)生于兒童期，需通過手術(shù)治療，并輔以化療改善患者的生存情況，但其5年生存率僅為5%～20%[1]。骨肉瘤惡性程度高，極易發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，是預(yù)后差的重要因素，因此研究骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)[2]。肝癌、肺癌、腸癌等研究中發(fā)現(xiàn)澳洲茄胺具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[3-5]。同時(shí)在易擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的肺癌和腸癌中發(fā)現(xiàn)，澳洲茄胺具有抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用[6,7]，但目前澳洲茄胺對骨肉瘤的作用尚不可知。AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路在諸多研究報(bào)導(dǎo)是腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)亡、侵襲和遷移的交匯點(diǎn)，是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程的重要信號通路之一[8-10]。因此本文研究了澳洲茄胺對骨肉瘤細(xì)胞增殖、調(diào)亡和侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)功能影響，并對其機(jī)制進(jìn)行探討，為進(jìn)一步揭示澳洲茄胺抗腫瘤作用靶點(diǎn)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的培養(yǎng)：購買于ATCC，是一株貼壁細(xì)胞，使用10%胎牛血清 (Gibco)的DMEM培養(yǎng)液 (Gibco)培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。澳洲茄胺處理：將細(xì)胞接種于孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入一定濃度的澳洲茄胺，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn) MG-63細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，用含不同濃度澳洲茄胺的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔3個(gè)，并設(shè)空白對照組，孵育48 h后向每孔加MTT液孵育1 h，然后加入20% SDS后測各孔光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上取平均值。

1.3 細(xì)胞凋亡 MG-63細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，用含不同濃度澳洲茄胺的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，再用胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗2次并收集細(xì)胞，后續(xù)步驟根據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(生工)說明書操作。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)：胰酶消化骨肉瘤細(xì)胞，分裝成兩管，分別用無血清DMEM培養(yǎng)基 (對照組)和含50 μmol/L澳洲茄胺的無血清DMEM培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)重懸，并使細(xì)胞終濃度為1×106個(gè)/ml。取100 ml細(xì)胞懸液加入transwell上室，在細(xì)胞下室24孔板中加入500 ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48 h后取出小室，吸棄上室培養(yǎng)基，用棉簽輕拭去上室細(xì)胞，結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗滌3次。在光學(xué)顯微鏡下，在五個(gè)隨機(jī)區(qū)域?qū)η秩氲募?xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先用無血清DMEM稀釋Matrigel至終濃度為100 μg/ml，鋪于Transwell小室底部，4℃風(fēng)干。每孔加入50 ml含10 g/L BSA的無血清DMEM，于37℃培養(yǎng)箱放置30 min水化基底膜，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot 用IP裂解液(Thermo Fisher Scientific)裂解并收集細(xì)胞，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒 (碧云天)檢測總蛋白濃度。加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液 (碧云天)，100℃沸水浴10 min，置于冰上冷卻。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，在室溫下用5%的脫脂奶粉封閉2 h，然后用HMGB1、TLR4、NFκB的一抗4℃孵育過夜。PBST洗滌3次后，用對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。洗滌3次后，用ECL顯色液 (碧云天)顯色，于凝膠成像儀器下曝光和拍照。使用Image J軟件測定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 澳洲茄胺對MG-63增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，在相同的處理時(shí)間內(nèi)，澳洲茄胺處理后細(xì)胞的抑制率顯著增加，且隨濃度增加抑制率越高；在相同濃度澳洲茄胺處理?xiàng)l件下，細(xì)胞抑制率則隨時(shí)間延長而不斷上升(P<0.05)。通過澳洲茄胺處理48 h時(shí)澳洲茄胺濃度與細(xì)胞抑制率趨勢線，計(jì)算出澳洲茄胺對MG-63的半抑制濃度為54.03 μmol/L。見表1，圖1。

表1 澳洲茄胺對MG-63抑制率的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.5；與10 μmol/L比較，#P<0.05；與20 μmol/L比較，△P<0.05；與40 μmol/L比較，☆P<0.05；與60 μmol/L比較，▲P<0.5

2.2 澳洲茄胺處理細(xì)胞，檢測細(xì)胞凋亡情況 應(yīng)用Annexin-V/PI雙染法檢測澳洲茄胺處理前后MG-63細(xì)胞調(diào)亡率發(fā)現(xiàn)：用50 μmol/L澳洲茄胺處理組的細(xì)胞早期凋亡率(7.83±1.28%)和晚期凋亡率(15.03±1.24%)均明顯高于對照組的早期凋亡率(3.23±0.84%)和晚期凋亡率(3.62±0.61%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。用50 μmol/L澳洲茄胺處理組的細(xì)胞總凋亡率(22.74±0.58%)明顯高于與不用澳洲茄胺處理的對照組的細(xì)胞總凋亡率(6.71±0.12%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 澳洲茄胺處理細(xì)胞，檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移情況 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50 μmol/L澳洲茄胺處理過的細(xì)胞遷移能力(294±8)個(gè)/視野與侵襲能力(181±16)個(gè)/視野均明顯低于對照組細(xì)胞遷移能力(406±13)個(gè)/視野和侵襲能力(295±10)個(gè)/視野，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖1 澳洲茄胺處理48 h時(shí)，澳洲茄胺濃度與細(xì)胞抑制率的關(guān)系

圖2 Annexin-V/PI雙染法檢測澳洲茄胺處理前后MG-63的細(xì)胞調(diào)亡率

2.4 澳洲茄胺對骨肉瘤細(xì)胞AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的作用 Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路中AKT、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，澳洲茄胺處理組的pAKT(灰度值：72.724，t=37.90,P<0.01)、pβ-cateninze(灰度值：119.606，t=41.82,P<0.01)均顯著低于對照組PAKT(灰度值：131.510)、pβ-cateninze(灰度值：135.544)，并且澳洲茄胺處理組pGSK-3β(灰度值：49.612)顯著高于對照組(灰度值：49.344)。見圖4。

圖3 澳洲茄胺對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；A Transwell檢測2組細(xì)胞的遷移情況；B Transwell檢測2組細(xì)胞的侵襲情況

圖4 澳洲茄胺處理前后AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路活化情況； A Western blot檢測2組細(xì)胞中AKT、GSK-3β、β-catenin、pAKT、pGSK-3β和pβ-catenin的蛋白情況；B 灰度分析Western blot檢測結(jié)果

3 討論

骨肉瘤以紡錘形的惡性腫瘤細(xì)胞形成不成熟的骨為病理特點(diǎn)，是原發(fā)惡性骨腫瘤，在兒童期最為多見[1]。目前治療方法以手術(shù)為主，輔以化療改善患者的生存情況[3]。但由于骨肉瘤本身惡性程度高、對化療不敏感、極易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，截肢后5年生存率并不理想[2]。目前針對骨肉瘤發(fā)生機(jī)制、耐藥問題以及轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)機(jī)制的研究越來越多的受到關(guān)注。因此通過本研究對骨肉瘤生長、侵襲轉(zhuǎn)移的研究，有助于控制腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，提高患者生存率，對骨肉瘤治療和預(yù)后評估等具有重要的臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)以龍葵為主要藥物組成的灌腸方治療腸癌療效顯著[11]。進(jìn)一步研究顯示灌腸方的水提物和醇提物中均檢測到龍葵的活性成分澳洲茄胺、澳洲茄堿及澳洲茄邊堿，其中前者是后二者水解后的苷元，這三種成分在腸癌治療中均顯示了較強(qiáng)的藥理活性[12,13]。澳洲茄胺是來源于茄屬植物的一種甾體生物堿，具有多種藥理活性，其抗腫瘤活性是目前研究的熱點(diǎn)之一[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)澳洲茄胺對腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，對乳腺癌、口腔表皮樣癌、慢性粒細(xì)胞白血病、前列腺癌細(xì)胞凋亡均有促進(jìn)作用，但作用機(jī)制尚未明確[14-18]。本文以骨肉瘤MG-63細(xì)胞為研究對象，探討澳洲茄胺對骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)澳洲茄胺具有抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這將為今后臨床治療骨肉瘤提供新的理論參考。

AKT/GSK-3β/β-catenin是PI3K與Wnt兩條信號通路的關(guān)鍵分子交匯成的一條通路，調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[8]。在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的活化能夠誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19,20]。另有在結(jié)直腸癌研究中腸癌細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞調(diào)亡、周期阻滯與AKT磷酸化減弱，GSK-3β活性增加，胞漿內(nèi)β-catenin的降解密切相關(guān)[19,20]。本文研究發(fā)現(xiàn)澳洲茄胺對骨肉瘤細(xì)胞MG-63的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移作用，可能與AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的活化相關(guān)。本研究初步探討了澳洲茄胺對人骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用及機(jī)制，但是仍然有許多不足之處：(1)本研究發(fā)現(xiàn)澳洲茄胺對MG-63細(xì)胞的生長發(fā)揮著重要作用，但澳洲茄胺是否普遍作適用于其他骨肉瘤細(xì)胞，尚不可知；(2)本研究發(fā)現(xiàn)澳洲茄胺通過AKT/GSK-3β/β-catenin影響細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移，但缺乏信號通路下游分別調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的蛋白的研究；(3)澳洲茄胺調(diào)控AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路的機(jī)制，還需要進(jìn)一步探討；(4)本文僅在細(xì)胞水平探討澳洲茄胺對骨肉瘤的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性均不如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此仍然需要進(jìn)一步構(gòu)建體內(nèi)動(dòng)物模型以驗(yàn)證結(jié)論。

綜上所述，澳洲茄胺通過活化AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，進(jìn)而可能控制骨肉瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，提高骨肉瘤患者生存率。