李雪梅 吳利瓊 張曉菊

宮頸癌(cervical cancer)是女性生殖道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病趨勢近年來呈年輕化[1]。誘發(fā)因素包括經(jīng)濟狀況、營養(yǎng)、婚育情況、病毒感染等，其中高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宮頸癌病變的主要因素[2]。發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病率明顯高于發(fā)達國家，且由于發(fā)展中及低收入國家宮頸癌篩查率低于發(fā)達國家，使得宮頸癌致死率高于發(fā)達國家[3]。目前宮頸癌的治療根據(jù)FIGO分期不同而有差別[4]。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NACT)為20世紀80年代興起的新治療手段，可用于局部晚期宮頸癌的治療[5]。吉西他濱(Gemcitabine)作為新型抗代謝抗癌藥，單獨或與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用作為新輔助化療方案對多種腫瘤具有較好的療效[6]，在宮頸癌的新輔助治療中也取得良好療效[7，8]。然而臨床應(yīng)用中仍有部分患者對吉西他濱化療具有耐藥性，從而降低了化療的療效及預(yù)后[9]。因此尋找合適的生物標記物評估患者預(yù)后，對宮頸癌個體化治療，臨床方案制定指導(dǎo)具有重要價值。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸活化過程中起著重要作用的關(guān)鍵還原酶，有研究報道MTHFR單核苷酸多態(tài)性與多種腫瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌、口腔鱗癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性也與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，其中MTHFR1298和MTHFR667是宮頸癌患者常見的突變位點[13，14]。本文分析MTHFR1298和677兩位點基因多態(tài)性對宮頸癌患者經(jīng)吉西他濱化療后療效及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年5月至2015年4月于我院就診接受吉西他濱化療的宮頸癌患者58例，搜集分析2組患者的年齡、分化程度等臨床病理資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者對本研究知情且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①患者經(jīng)病理活檢確診為宮頸癌；②治療前患者未接受其他放化療；③年齡20～80歲；④臨床病病理資料完整。

1.2.2 排除標準：①合并其他惡性腫瘤的患者；②患有精神疾病或認知功能障礙的患者；③組織量不足而影響基因型分析的患者。

1.3 方法 患者均給予靜脈滴注吉西他濱(澤菲，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)1 000 mg/m2，30 min滴注完畢，21 d為1個療程，共治療2個療程。每個療程結(jié)束后7～10 d對療效進行評估，如化療有效則繼續(xù)下1個療程的療效，如無效或進展者則根據(jù)病情行手術(shù)治療或放化療。

1.4 檢測方法 (1)石蠟組織DNA提?。焊鶕?jù)石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(寧波市重鼎生物技術(shù)有限公司)說明書流程提取DNA。(2)PCR擴增：根據(jù)不同引物的進行擴增，反應(yīng)體系包括10 μl 2×Taq Master Mix，1 μl引物，0.4 μl探針，8.6 μl DNA。反應(yīng)經(jīng)40個循環(huán)，每個循環(huán)為95℃ 3 min，95℃ 12 s，62℃ 40 s，95℃ 12 s。(3)酶切反應(yīng)：擴增后分別用限制性內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系包括4 μl 5×Reation Buffer，1 μl限制性內(nèi)切酶，6 μl PCR純化產(chǎn)物，9 μl高壓Free dH2O。其中MTHFR1298使用MboⅡ內(nèi)切酶，MTHFR667使用HinfⅠ內(nèi)切酶。(4)選取適合PCR產(chǎn)物大小的瓊脂糖凝膠濃度，將配置好的瓊脂糖溶于Tris/Borate/EDTA(TBE)緩沖液中，加熱使之澄清透明。待溶液冷卻后加入凝膠染料，隨后將凝膠溶液倒入膠膜，梳尺固定并取出凝膠后置于瓊脂糖凝膠電泳儀中，上樣，于150 V電壓下常溫跑電泳30 min，并用凝膠成像儀觀察結(jié)果。見表1。

1.5 近期療效評價 化療停止后根據(jù)實體瘤療效評價標準15對患者進行療效評價，療效分為4個等級：完全緩解(CR)： 腫瘤消失; 部分緩解(PR):腫瘤體積減小占比>30%；疾病穩(wěn)定或無變化(SD)：腫瘤體積減小占比<30%或增大占比<20%；進展(PD)：腫瘤體積增大占比>20%；其中總有效率為CR+PR。

表1 PCR引物序列和限制性內(nèi)切酶類型

1.6 隨訪 宮頸癌患者化療結(jié)束后分別于3個月、6個月1年來院復(fù)查，包括患者的陰道細胞學(xué)檢查、盆腔檢查、影像學(xué)及腫瘤標志物檢查。隨后進入生存隨訪階段，每3個月的電話隨訪，記錄患者的身體狀況及是否復(fù)發(fā)，患者死亡為隨訪終點。隨訪截止時間為2018年6月，末次隨訪仍存活的患者以結(jié)尾值計算，隨訪期間失訪以刪失處理。共3例患者失訪。

2 結(jié)果

2.2 MTHFR 1298A/C和667C/T基因型頻率 MTHFR 1298A/C位點的AA、AC、CC基因型頻率分別為46.5%、25.9%、27.6%；MTHFR 667C/T位點的CC、CT、TT基因型頻率分布為56.9%、29.3%、13.8%。見表2。

表2 MTHFR 1298A/C和667C/T基因型頻率 例(%)

2.3 MTHFR基因多態(tài)性與宮頸癌臨床病理特征的相關(guān)性 患者的年齡、病理類型、分化程度均及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MTHFR 1298和677兩位點的基因型無關(guān)，而患者的腫瘤分期僅與MTHFR 677位點的基因多態(tài)性相關(guān)(P=0.026)，與MTHFR 1298位點的基因多態(tài)性無關(guān)(P> 0.05)。見表3。

表3 MTHFR 1298和677基因多態(tài)性與臨床病理間的關(guān)系 例

2.4 MTHFR 1298和677基因多態(tài)性與近期療效間的關(guān)系 患者治療3個月時的療效顯示，總有效率為31.0%，進一步分析療效與MTHFR 1298和677位點基因多態(tài)性的相關(guān)性，患者接受吉西他濱化療后的短期療效與MTHFR兩位點的基因多態(tài)性均不相關(guān)(P>0.05)。見表4。

表4 MTHFR 1298和677基因多態(tài)性與近期療效間的關(guān)系 例

2.5 MTHFR 1298和677基因多態(tài)性與遠期療效間的關(guān)系 在隨訪過程中，有3例患者因更改聯(lián)系方式而失訪。剩余55例患者中，有22例患者在隨訪過程中因?qū)m頸癌進展和復(fù)發(fā)而死亡，患者3年總體無病生存率為49.1%，總生存率為60%?；颊咚劳鰹殡S訪終點，失訪患者為刪失數(shù)據(jù)(3例)。用Kaplan-Meier 單因素生存曲線分析宮頸癌患者無病生存率和總生存率與MTHFR 1298和677基因型分布情況、臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，log-rank 檢驗分析患者各因素的統(tǒng)計學(xué)差異。宮頸癌患者無病生存率和總生存率與MTHFR 1298和677位點基因多態(tài)性及臨床病理間的關(guān)系分析顯示，MTHFR兩位點的基因多態(tài)性、臨床病理特征與患者的長期預(yù)后無顯著相關(guān)(P> 0.05)。見表5。

3 討論

由于宮頸癌具有較高的易感性，其在女性中的發(fā)病率一直居高不下，嚴重影響著患者的生活。放化療作為宮頸癌的主要治療方案，雖具有較好的療效，但仍有部分患者出現(xiàn)化療藥耐藥現(xiàn)象。吉西他濱作為去氧胞苷的類似物，可通過抑制核糖核苷還原酶而阻止DNA的修復(fù)和合成，進而抑制細胞復(fù)制，最終達到抗腫瘤的效果[15,16]。Swisher等[8]研究報道每周在順鉑和盆腔放療中加入低劑量的吉西他濱可提高療效。劉桂軍等[6]報道吉西他濱聯(lián)合順鉑新輔助化療非小細胞肺癌，可能誘導(dǎo)TXNIP 基因mRNA的表達，使TXNIP 蛋白表達水平上調(diào)，從而加強其對TrxR 的抑制，進而對硫氧還蛋白清除活性氧能力產(chǎn)生抑制了作用，最終達到腫瘤生長抑制作用。此外，胡旻等[7]通過使用吉西他濱聯(lián)合順鉑作為新輔助化療方案治療宮頸癌患者發(fā)現(xiàn)，該方案相較于系列霉素和順鉑化療方案具有更好的額臨床療效。而然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)部分宮頸癌患者對吉西他濱具有耐藥性，該耐藥性與介導(dǎo)吉西他濱攝入的人平衡核苷轉(zhuǎn)運蛋白1(human Equilibrative Nucleoside Transporter 1，hENT1)有關(guān)，在耐細胞中(CaLoGR)hENT1表達下調(diào)[9]。

遺傳易染性作為宮頸癌發(fā)生的內(nèi)源性因素，其與患者接受化療后的療效及預(yù)后可能相關(guān)。MTHFR作為葉酸代謝中不可或缺的酶，具有活化葉酸的功能。葉酸與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，當(dāng)葉酸攝入不足導(dǎo)致水平較低時，腫瘤發(fā)生率增加。其可能是因為體內(nèi)低葉酸水平導(dǎo)致DNA中尿嘧啶的錯誤插入和基因組DNA的低甲基化，進而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性和腫瘤的發(fā)生[17]。MTHFR常見的基因多態(tài)性有1298A/C和677C/T兩種，研究顯示，MTHFR 677位點C突變到T，或1298位點A突變到C時，DNA甲基化、合成及修復(fù)受阻，從而可能成為宮頸癌發(fā)生的易感因素[18]?；诖耍疚膶THFR基因多態(tài)性及其與吉西他濱化療療效及預(yù)后的相關(guān)性做了分析。研究結(jié)果顯示，MTHFR 1298A/C位點的AA、AC、CC基因型頻率分別為46.5%、25.9%、27.6%；MTHFR 667C/T位點的CC、CT、TT基因型頻率分布為56.9%、29.3%、13.8%。MTHFR 1298A/C位點和677C/T位點基因多態(tài)性與臨床病理關(guān)系分析顯示僅MTHFR 667C/T的基因多態(tài)性與患者腫瘤分期相關(guān)，而MTHFR 1298A/C位點和677C/T位點與患者的年齡、病理類型、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著相關(guān)(P> 0.05)。Jae等[19]報道當(dāng)MTHFR 667C/T位C突變到T時，其編碼的丙氨酸將被纈氨酸替代，從而降低MTHFR催化活性，影響葉酸的正常生理功能，從而引發(fā)DNA甲基化異常和DNA修復(fù)受阻，最終導(dǎo)致腫瘤惡化，臨床分期升高。與本文結(jié)果一致，提示MTHFR 667C/T位點的基因多態(tài)性為腫瘤分期的判別提供了參考。

表5 MTHFR 1298和677基因多態(tài)性及臨床病理與生存率間的相關(guān)性 例(%)

進一步分析MTHFR 1298A/C位點和677C/T位點與吉西他濱化療療效和預(yù)后的關(guān)系表明，MTHFR兩位點的基因多態(tài)性與近、遠期療效均不相關(guān)。MTHFR的多態(tài)性與腫瘤發(fā)生、進展間的關(guān)系是當(dāng)前的研究熱點，然而其與腫瘤間的相關(guān)性仍無明確定論。Nemah Awwad等[20]報道MTHFR 677C/T位點的基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)，而1298A/C位點與乳腺癌無關(guān)。Gonzales等[21]則表明MTHFR 677C/T和1298A/C位點基因多態(tài)性對乳腺癌易染性的影響因地區(qū)而異，在澳洲、東亞、中東、南歐、摩洛哥和美國MTHFR 677 TT突變型可導(dǎo)致較高的乳腺癌發(fā)病率，而在亞洲、中東、南歐、南美等地則MTHFR 1298 CC突變型對乳腺癌的易染性影響較大。MTHFR基因型對宮頸癌的影響與之類似，Gong等[14]發(fā)現(xiàn)MTHFR 677位點的基因多態(tài)性與宮頸癌的發(fā)生無關(guān)，1298位點的基因多態(tài)性則與宮頸癌密切相關(guān)。然而，Lambropoulos等[22]卻闡明MTHFR 677位點基因多態(tài)性與宮頸癌病變無關(guān)。該差異可能與所選擇的地區(qū)、人種有關(guān)。

綜上所述，MTHFR 1298和677位點的基因多態(tài)性與宮頸癌患者接受吉西他濱治療后的療效及預(yù)后均無顯著相關(guān)性。但本文仍存在樣本數(shù)較少，取樣多樣性欠缺等局限，故需大樣本、多地區(qū)、多民族、長期試驗進行驗證。