宮蕊 熱依拉·牙合甫 張國亮 任珊 陳曼麗 陳孟暉 李海濱 趙成

2型糖尿病(T2DM)和冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)密切相關(guān)，影響公眾健康，加重了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。冠狀動(dòng)脈疾病是2型糖尿病的常見并發(fā)癥，其中斑塊形成致使冠狀動(dòng)脈變窄，嚴(yán)重程度影響患者冠狀動(dòng)脈疾病分級(jí)。T2DM和CAD常常與POMP、肥胖等疾病同時(shí)存在。T2DM與CAD具有諸多共同危險(xiǎn)因素，如年齡，性別，體重，生活方式，心理社會(huì)壓力和暴露于環(huán)境污染物等，兩者均具有慢性炎癥[1,2]和凝血系統(tǒng)紊亂特征[3]。2型糖尿病與心血管疾病發(fā)生以及死亡風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)[4,5]。潛在機(jī)制與胰島素抵抗、非自主調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、凝血異常、動(dòng)脈壁生物反應(yīng)效應(yīng)易感基因之間復(fù)雜的相互作用等有關(guān)[6]。Wu等[7]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病，肥胖和冠狀動(dòng)脈疾病在基因敏感區(qū)域(bin 9.3和6.5)均有表達(dá)共享?；蚪M信息(正常狀態(tài)、疾病相關(guān))，尤其是在高通量技術(shù)對(duì)認(rèn)識(shí)疾病的復(fù)雜生物過程具有重要價(jià)值[8]。本研究通過比較2型糖尿病和冠狀動(dòng)脈疾病基因表達(dá)譜，探討兩者之間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集確診患者及健康者(對(duì)照組)共計(jì)20例。其中T2DM患者2例，CAD患者2例，T2DM合并CAD者6例(T2DM+CAD)，對(duì)照組10例。T2DM患者符合世界衛(wèi)生組織診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；PCI術(shù)后、CABG患者以及冠脈CTA血管限流>75%患者作為CAD患者入組標(biāo)準(zhǔn)[10]。T2DM與CAD并發(fā)患者滿足上述2個(gè)入選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組為健康人群，年齡性別比例符合試驗(yàn)要求。本研究無藥物干預(yù)同時(shí)不干預(yù)患者用藥，通過倫理審批，向所有受試者提供書面知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 TRIZOL試劑；TruSeq RNA文庫制備試劑盒 Ribo-Zero Magnetic kit；random primer；Superscript III；USER酶；三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇(分析純)；DEPC water；低溫高速離心機(jī)；ABI7500型快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；Nanodrop ND-2000超微量紫外分光光度計(jì)；Hiseq2500。

1.3 主要統(tǒng)計(jì)平臺(tái)及軟件TopHat v1.3.1 軟件；Cufflinks v1.0.3軟件；GENECODIS軟件；Cytoscape軟件；bwa軟件；SeqPrep軟件；GOrilla軟件。

1.4 qRT-PCR檢測(cè) 使用Trizol試劑從血液樣品中提取總RNA。使用Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)量RNA的質(zhì)量和數(shù)量。RNA完整性檢測(cè)方法：Agilent 2100、瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖凝膠濃度：1%瓊脂糖膠；電壓：5 V/cm；時(shí)間：20 min)。

1.5 建庫測(cè)序 PCR擴(kuò)增15個(gè)cycles，后應(yīng)用HiSeq TM 2500平臺(tái)第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)mRNA進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)行測(cè)序。通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染變性稀釋后的文庫加入到鞘流池(FlowCell)內(nèi)，與FlowCell 上的接頭雜交，完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。

1.6 分析數(shù)據(jù) 實(shí)驗(yàn)對(duì)mRNA數(shù)據(jù)分別進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)分析及mRNA共表達(dá)分析。樣本數(shù)≥6時(shí)，使用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析樣本間mRNA與蛋白編碼基因的相關(guān)性。該分析中，采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析樣本間mRNA與蛋白編碼基因的相關(guān)性，閾值使用0.9。

1.6.1 差異表達(dá)基因分析:應(yīng)用TopHat v1.3.1軟件[11]將原始測(cè)序所得與UCSC(University of California Santa Cruz)人類參考基因組(Build hg19)進(jìn)行比對(duì)。利用Cufflinks v1.0.3軟件對(duì)原始比對(duì)文檔進(jìn)行處理，衡量轉(zhuǎn)錄樣本豐度[12]；鑒別差異表達(dá)基因：應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)用于鑒別差異表達(dá)基因。P<0.05作為基因表達(dá)顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)。用pheatmap熱圖代碼R函數(shù)/Bioconductor包對(duì)差異表達(dá)基因執(zhí)行層次集群聚類計(jì)算；差異表達(dá)基因功能富集分析：應(yīng)用在線軟件GENECODIS對(duì)差異表達(dá)基因，采用基因本體論數(shù)據(jù)(GO)富集分析和京都基因基因組百科全書(KEGG)通路分析方法，進(jìn)行生物學(xué)功能注釋[13]。GOrilla軟件驗(yàn)證GO分析結(jié)果。

1.6.2 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:基于在線數(shù)據(jù)庫生物相互作用通用數(shù)據(jù)集(BioGRID，http://thebiog rid.org/)，建立蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPIs)[14,15]，應(yīng)用Cytoscape軟件對(duì)所選基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中的分布特征進(jìn)行可視化處理。PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，而鏈接點(diǎn)之間的邊表示2個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用聯(lián)系。

1.7 通過GSE23561基因表達(dá)驗(yàn)證 依據(jù)以往的研究和數(shù)據(jù)庫注釋選擇GSE23561數(shù)據(jù)集(GEO,http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[16]。證實(shí)篩選的主要差異表達(dá)基因。從而證明本研究高通量數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，以期彌補(bǔ)樣本量小可能帶來的差異表達(dá)基因測(cè)序的單芯片假陽性或假陰性可能。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 CAD、T2DM、T2DM+CAD以及對(duì)照組，測(cè)定生成3.28 ×107,2.88×107,3.30×107和2.28×107條測(cè)序讀數(shù)。與選擇的UCSC數(shù)據(jù)庫提供的人類參考基因組Build hg19進(jìn)行對(duì)比，各組具有獨(dú)特相對(duì)總讀數(shù)分別為2.17×107,1.90×107,2.18×107和1.51×107。

2.2 組間基因差異表達(dá)

2.2.1 T2DM與對(duì)照組差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，T2DM有474個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)基因126個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因348個(gè)。其中92個(gè)GO注釋的基因顯著差異表達(dá)。帕金森氏病的通路在T2DM組中高度富集表達(dá)(P=0.001)，提示T2DM可能促進(jìn)帕金森病的發(fā)生發(fā)展。見表1。

2.2.2 CAD與對(duì)照組差異表達(dá)分析：CAD有488個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中有400個(gè)基因是上調(diào)的另外88個(gè)下調(diào)表達(dá)。趨化因子信號(hào)通路是其中最顯著的富集途徑之一(P=6.14E-11)。見表2。

表1 T2DM中差異表達(dá)基因前15條顯著富集通路

表2 CAD中差異表達(dá)基因前15條顯著富集通路

2.2.3 T2DM+CAD與對(duì)照組差異表達(dá)分析:T2DM+CAD組總共分析發(fā)現(xiàn)439個(gè)差異表達(dá)基因，370個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，69個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因。其中最顯著的富集通路為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(GO:0007165,P=2.94E-07) 以及抗細(xì)胞凋亡(GO:0006916,P=2.86E-06)。見表3。

2.3 CAD、T2DM、T2DM+CAD相關(guān)性 發(fā)現(xiàn)191個(gè)基因有較強(qiáng)的重疊表達(dá)。計(jì)算兩兩之間Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，CAD,T2DM,和T2DM + CAD者之間存在顯著的相關(guān)性(P<0.0001)，其中T2DM與T2DM+CAD的相關(guān)性在外周血基因表達(dá)譜中最為顯著(Spearman’s rho=0.6757,P<0.0001)。CAD、T2DM和T2DM + CAD共同差異表達(dá)基因主要通過核糖體(P=2.77E-06),黏著斑(P=0.03),細(xì)胞凋亡(P=0.03),小細(xì)胞肺癌(P=0.03),RIG-I樣受體信號(hào)通路(P=0.03),礦物質(zhì)吸收(P=0.04),白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(P=0.04)等通路參與差異表達(dá)。見表4。

2.4 疾病特異性PPI網(wǎng)絡(luò)圖 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)處理：最終得到47個(gè)基因涉及在T2DM特定PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。其中包括1 216個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)和1 579條相互聯(lián)系的邊。其中包括重要的樞紐蛋白TCF4 (Degree=169),SKP1 (Degree=164) 以及UBE2W (Degree=75),說明了它們?cè)赥2DM發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用；最終得到54個(gè)基因，與CAD特定PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。其中包括943蛋白節(jié)點(diǎn)和1 085條相互聯(lián)系的邊。54個(gè)基因中包括重要的樞紐蛋白有HIF1A (Degree=124),SMAD1 (Degree=112)以及SKIL (Degree=94),說明這3個(gè)基因在CAD的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵的作用。見圖1、2。

表3 T2DM + CAD組差異表達(dá)基因高表達(dá)通路

表4 T2D、CAD、T2D + CAD共同差異表達(dá)基因顯著富集通路

2.5 GSE23561基因數(shù)據(jù)庫基因表達(dá)驗(yàn)證 選擇在CAD組中HIF1A,SMAD1和 SKIL顯著差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，HIF1A,SMAD1和 SKIL為CAD特定PPI網(wǎng)絡(luò)圖中樞紐蛋白。在所選GSE23561基因數(shù)據(jù)庫提供的表達(dá)數(shù)據(jù)中，HIF1A,SMAD1以及SKIL基因在CAD組中全部為上調(diào)表達(dá)基因，T2DM與正常對(duì)照組相比SMAD1以及SKIL基因表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化。HIF1A在CAD和T2D中表達(dá)不同。

3 討論

本研究應(yīng)用RNA-seq識(shí)別T2DM、CAD以及兩病共存情況下外周血獨(dú)特的基因表達(dá)特征。比較了T2DM、CAD以及兩病共存條件下的基因表達(dá)譜，分析相關(guān)性，探索共存病理生理機(jī)制。

T2DM和CAD基因表達(dá)譜均表現(xiàn)為凝血系統(tǒng)功能紊亂，局部炎性反應(yīng)與脂質(zhì)代謝失調(diào)。T2DM和CAD的共同病理生理特征可能與類似共同遺傳變有關(guān)，如CDKN2A/2B,ADIPOR1[17]和TCF7L2基因的變異[18]。其中T2DM與T2DM + CAD的相關(guān)性最為顯著。重疊表達(dá)基因主要富集于GO注釋的病毒感染周期、抗細(xì)胞凋亡，內(nèi)分泌腺胰腺的發(fā)育，先天免疫應(yīng)答，凝血功能等通路。這些重疊基因主要參與核糖體相關(guān)的通路(RPS3A,UBA52,RSL24D1,RPL7,RPL39,RPL21,RPS24,RPS12)。

T2DM或CAD發(fā)展過程中起特殊作用的基因數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，在T2DM特異性PPI網(wǎng)絡(luò)中，顯著的樞紐蛋白為TCF4 (Degree=169),SKP1 (Degree=164) 以及UBE2W (Degree=75)。其中TCF4，又名轉(zhuǎn)錄因子7-like 2 (TCF7L2)，是編碼參與Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子。TCF4刺激胰腺β-cells的增殖,調(diào)節(jié)胰腺在胚胎發(fā)育時(shí)期的質(zhì)量。并誘導(dǎo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌胰島素促生長激素胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)[19]，在血糖的穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。且多研究表明TCF7L2基因型與T2DM之間存在相關(guān)性[20-24]。Meta分析發(fā)現(xiàn)TCF7L2 rs7903146基因的多態(tài)性與中國人群T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。CAD特異性PPI網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)， SMAD1和SKIL在CAD中特異性上調(diào)表達(dá)，在T2DM中無顯著變化； HIF-1α為HIF1A基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，具有維持氧穩(wěn)態(tài)功能。

HIF1A可能通過激活多種基因參與CAD的發(fā)生和發(fā)展與正常對(duì)照組相比，CAD患者的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中VEGF,HO-1,ET-1，HIF1A信使RNA表達(dá)顯著上調(diào)；HIF1A的表達(dá)水平與動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度和動(dòng)脈硬化程度的間接評(píng)分具有高度相關(guān)性。一項(xiàng)研究表明,HIF1A多態(tài)性(rs11549465和rs11549467)與冠狀動(dòng)脈疾病的臨床類型和冠狀動(dòng)脈側(cè)枝的形成有關(guān)[20]。并且有相關(guān)研究證實(shí)HIF1A的rs2057482 SNP的多態(tài)性表達(dá)與早期CAD易感性的增加有關(guān)，可作為早期冠狀動(dòng)脈疾病易感性標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷[21]。

圖1 T2DM中64個(gè)失調(diào)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖；紅色節(jié)點(diǎn)表示上調(diào)基因，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示下調(diào)基因；粉紅色的節(jié)點(diǎn)表示與差異表達(dá)基因相互作用的基因，較大的圖標(biāo)表示樞紐蛋白

有證據(jù)表明HIF1A多態(tài)性(g.C45035TSNP、rs11549465)與T1DM和T2DM均存在相關(guān)性[22]。并且HIF1A可以過綁定ARNT啟動(dòng)子造成小鼠β細(xì)胞特定HIF1A破壞，影響β細(xì)胞功能[23]。HIF1A在缺血性心肌細(xì)胞高血糖狀態(tài)時(shí)抑制HIF-1αm RNA表達(dá)，抑制HIF-1α缺血應(yīng)答[24,25]，表明心肌梗死事件發(fā)生時(shí)以及隨后的死亡率與高血糖狀態(tài)正相關(guān)。

圖2 CAD中69個(gè)失調(diào)表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖；紅色節(jié)點(diǎn)表示上調(diào)基因，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示下調(diào)基因；粉紅色的節(jié)點(diǎn)表示與差異表達(dá)基因相互作用的基因，較大的圖標(biāo)表示樞紐蛋白

SMAD1和SKIL均參與SMAD通路，它們?cè)诠跔顒?dòng)脈疾病中均顯著上調(diào)表達(dá)，在2型糖尿病中表達(dá)無變化。Tseng 等研究發(fā)現(xiàn)，SMAD1多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈疾病患者心臟驟停有關(guān)[26]。在心臟特異性過表達(dá)SMAD1的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠缺血再灌注損傷(I/R)后心肌梗死明顯減少，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，提示SMAD1具有在缺血再灌注損傷后心臟保護(hù)中的作用[27,28]。SKIL是SMAD通路組成部分，被證明參與了心臟細(xì)胞纖維化的過程[29,30]。

TCF4、SKP1與UBE2W為2型糖尿病的關(guān)鍵調(diào)控基因；HIF1A、SMAD1與SKIL為冠狀動(dòng)脈疾病的關(guān)鍵調(diào)控基因。CAD樞紐蛋白為HIF1A,SMAD1與SKIL三個(gè)基因在CAD的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用。HIF1A在CAD患者中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；SMAD1和SKIL基因在冠狀動(dòng)脈疾病中顯著上調(diào)表達(dá)，具有缺血再灌注保護(hù)作用。冠狀動(dòng)脈疾病、2型糖尿病、2型糖尿病+冠狀動(dòng)脈疾病，之間存在共有的調(diào)控基因，可能具有相似的病理分子機(jī)制。