趙瑞華，賀曉龍，田茜

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000；2.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西延安716000；3.延安大學(xué)經(jīng)濟(jì)與管理學(xué)院，陜西延安716000）

羊肚菌（Morchella spp.）屬于子囊菌亞門（Ascomycotina），盤菌綱（Discomycetes），盤菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellacea），羊肚菌屬（Morchella），民間又名羊肚菜、草笠竹、網(wǎng)兜蘑等，其菌蓋表層呈棱脊型網(wǎng)狀體，外觀像羊肚[1-2]。羊肚菌富含各類營養(yǎng)物質(zhì)，且肉質(zhì)脆嫩，風(fēng)味獨(dú)特，而且含有多種抗菌、抗病毒的活性成分和能夠抑制腫瘤的多糖，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗疲勞等諸多作用，食藥用價(jià)值極高，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊[3-4]。

由于野生羊肚菌天然資源有限，環(huán)境條件要求苛刻，人工雖有大規(guī)模栽培但產(chǎn)量不穩(wěn)定，產(chǎn)品品質(zhì)參差不齊，所以急需尋求一種周期短、產(chǎn)量高的生產(chǎn)途徑[5]。而利用現(xiàn)代液體發(fā)酵生物工程技術(shù)，不僅大幅度提高菌絲體的積累量，同時(shí)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化程度高，可作為替代途徑。研究證明發(fā)酵培養(yǎng)的羊肚菌菌絲體和野生及人工栽培的子實(shí)體在營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)方面基本相同，且液體發(fā)酵成本低、工藝設(shè)備簡單，還能夠突破羊肚菌生長的環(huán)境限制因素，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的菌絲體及其發(fā)酵產(chǎn)物。本文綜述了國內(nèi)外關(guān)于羊肚菌的營養(yǎng)成分、揮發(fā)性成分及活性成分、液體發(fā)酵培養(yǎng)工藝和發(fā)酵液開發(fā)應(yīng)用方面的研究進(jìn)展，以期為羊肚菌液體發(fā)酵的深入研究和應(yīng)用提供參考。

1 羊肚菌發(fā)酵物主要營養(yǎng)和活性成分

有關(guān)研究表明，羊肚菌發(fā)酵物（菌體和發(fā)酵液）和子實(shí)體一樣不僅富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，還富含多糖、多酚、甾醇、酶類等活性成分，賦予羊肚菌發(fā)酵物極高的利用價(jià)值[6]。

1.1 主要營養(yǎng)成分

羊肚菌發(fā)酵液菌絲體中蛋白質(zhì)含量大于20%，其中人體必需氨基酸含量略低于子實(shí)體，氨基酸營養(yǎng)價(jià)值均衡。羊肚菌發(fā)酵液菌絲體中維生素和脂肪酸含量豐富，種類都較多，尤其不飽和脂肪酸的大量存在賦予其降血脂、抗衰老、消除自由基的功效。在發(fā)酵液和菌體中檢測到豐富的碳水化合物和16種礦物元素，但未檢測出對人體有害的重金屬Hg、Pb、Cd和As，從安全性來說優(yōu)于子實(shí)體。綜合近幾年研究，羊肚菌發(fā)酵物營養(yǎng)成分種類見表1。

表1 羊肚菌發(fā)酵物營養(yǎng)成分種類Table 1 Categories of nutrients in fermentation of Morchella esculenta

羊肚菌發(fā)酵物中含有大量的多糖，一般認(rèn)為多糖是起藥理作用的主要活性物質(zhì)，也是羊肚菌可以提高機(jī)體免疫力、抗病毒、抗癌及抗疲勞等作用的基本物質(zhì)成分；此外也發(fā)現(xiàn)游離酚、結(jié)合酚，其提取物存在細(xì)胞抗氧化作用，可以有效的抑制HepG2細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞的增殖；有研究證明從羊肚菌發(fā)酵菌絲體中提取出的三萜類化合物具有一定的抗氧化活性和抑制腫瘤細(xì)胞的能力。綜合近幾年研究，羊肚菌發(fā)酵物活性成分種類見表2。

表2 羊肚菌發(fā)酵物活性成分種類Table 2 Categories of active components in fermentation of Morchella esculenta

1.2 主要揮發(fā)性成分

羊肚菌菌絲體和發(fā)酵液還含有醇類、酮類、醛類、烴類、烯類、酸類和呋喃類等復(fù)雜的揮發(fā)性風(fēng)味成分，這些揮發(fā)性化合物之間相互作用、相互平衡賦予了羊肚菌發(fā)酵物獨(dú)特的風(fēng)味。發(fā)酵液中主要的揮發(fā)性物質(zhì)是以1-辛烯-3-醇和苯乙醇為主的醇類化合物；菌絲體中揮發(fā)性醇類化合物主要是苯乙醇和1-辛烯-3-醇這樣的八碳化合物，其中苯乙醇對羊肚菌菌體風(fēng)味起主要作用，是最簡單的芳香醇之一[21]。綜合近幾年研究，羊肚菌發(fā)酵液和菌絲體揮發(fā)性成分見表3。

2 羊肚菌的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)

在羊肚菌生長發(fā)育過程中將必需的營養(yǎng)物質(zhì)混合在水溶液中，通過人為控制其培養(yǎng)條件，可以培養(yǎng)出大量菌絲體，且在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中，羊肚菌可產(chǎn)生與從天然采集的羊肚菌子實(shí)體化學(xué)組成相近的各種成分。且液體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基原料來源豐富，培養(yǎng)條件易于控制，周期短，產(chǎn)量穩(wěn)定。據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，1958年美國Szuecs首次利用液體發(fā)酵培養(yǎng)出羊肚菌菌絲體，并設(shè)計(jì)了利用發(fā)酵桶進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的試驗(yàn)[22]。我國較早的報(bào)道是1986年Ghosh和王曉明的一篇譯文，介紹了利用單碳源、食品和工業(yè)廢料作基質(zhì)，對羊肚菌進(jìn)行深層培養(yǎng)的結(jié)果[23]。羊肚菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)己經(jīng)成為羊肚菌栽培的一種新模式，也是近年來對羊肚菌研究的熱點(diǎn)。通過對羊肚菌發(fā)酵液菌絲體營養(yǎng)成分的研究，為羊肚菌活性成分的深層開發(fā)以及實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商品化生產(chǎn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。法國、美國等國家開始進(jìn)行工業(yè)化液體發(fā)酵，大規(guī)模生產(chǎn)羊肚菌菌絲體，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等各領(lǐng)域[24]。羊肚菌發(fā)酵也有了專用的發(fā)酵設(shè)備。

表3 羊肚菌發(fā)酵液和菌絲體揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components in fermentation and mycelium of Morchella esculenta

我國早期的探索側(cè)重于發(fā)酵培養(yǎng)基配方的篩選。高愛華等[25]曾對羊肚菌液體培養(yǎng)進(jìn)行初步探索，篩選出液體培養(yǎng)基配方，但是培養(yǎng)時(shí)間過長，需要9 d才能放罐，并且需要添加昂貴的麥芽。張松[26]探討高羊肚菌菌絲球在不同液體培養(yǎng)基中的生長情況，發(fā)現(xiàn)在黃豆芽玉米粉培養(yǎng)基中菌絲球最多，大小均勻，菌絲生長量最大，在麥鼓蛋白陳培養(yǎng)基上菌絲中的糖含量最高。王小雄等[27]對采自甘南的尖頂羊肚菌（Morchella conica）經(jīng)深層發(fā)酵得到發(fā)酵液和菌絲體，并測定其中的營養(yǎng)成分。劉士旺等[28]和趙啟良等[29]則通過正交試驗(yàn)篩選出羊肚菌搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并探索羊肚菌液體發(fā)酵的合適條件。

近年來，Ma等[30]研究在攪拌槽生物反應(yīng)器中進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)不同攪拌方式對羊肚菌菌絲生長的影響，發(fā)現(xiàn)間歇攪拌可提高菌絲體的生長速率、生物量濃度和最大生產(chǎn)力。王瑩等[31]研究羊肚菌液體深層發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，基于Matlab軟件平臺，應(yīng)用遺傳算法就真菌生長較常用的Logistic與Monod方程在描述羊肚菌生長動(dòng)力學(xué)時(shí)的優(yōu)劣進(jìn)行對比，并估計(jì)了羊肚菌的生長、胞外多糖產(chǎn)生和基質(zhì)消耗模型的參數(shù)。羊肚菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立奠定了發(fā)酵優(yōu)化及放大的基礎(chǔ)。這一時(shí)期對培養(yǎng)基配方的篩選和條件的優(yōu)化日趨成熟，王云龍篩選的羊肚菌液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基為：麥芽汁9.5%、玉米粉40 mg/L、黃豆粉20 mg/L、酵母粉3 mg/L。最優(yōu)培養(yǎng)條件為：溫度（24±1）℃、轉(zhuǎn)速 140 r/min、pH 6.0以及接種量10%[32]。季向陽等篩選的液體發(fā)酵最佳轉(zhuǎn)速、pH值及接種量同王云龍，溫度為25℃恒溫培養(yǎng)120 h[33]。滕國生等[34]利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對影響羊肚菌發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的諸多因素進(jìn)行考察，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對篩選得到的關(guān)鍵因素深入優(yōu)化，對試驗(yàn)結(jié)果分別進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法分析，獲得羊肚菌5 L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)最佳條件：初始 pH 6.83，轉(zhuǎn)速 200 r/min，發(fā)酵時(shí)間 4.5 d，發(fā)酵溫度26℃，接種量3%，種齡3 d，通氣量200 L/h，裝液量3.22L/5L。而后李紅等[35]以梯棱羊肚菌（Morchella importuna）菌株FY2為試材，利用正交試驗(yàn)對液體配方和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明菌絲培養(yǎng)最適條件為溫度25℃，初始pH 7，接種量5%；分別選擇葡萄糖和黃豆粉做為羊肚菌菌絲生長的最佳碳源和氮源。

目前通過對液體發(fā)酵的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化來獲得某種目的產(chǎn)物己經(jīng)成為液體深層培養(yǎng)的一種發(fā)展趨勢，它有利于對羊肚菌的各種化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，并滿足消費(fèi)者的需求。

3 羊肚菌液體發(fā)酵的應(yīng)用

通過液體發(fā)酵，羊肚菌菌絲體獲得成品的時(shí)間相對于羊肚菌子實(shí)體而言大大縮短，并在獲得有效化學(xué)成分等方面存在優(yōu)勢，現(xiàn)在越來越多的研究者熱衷于開發(fā)以羊肚菌液體發(fā)酵菌絲體為原料的產(chǎn)品。

3.1 液體制種

在羊肚菌人工栽培中，固體制種方式耗時(shí)長、純度低、菌齡不一致、成本高，無法滿足羊肚菌規(guī)?；咝г耘嗟男枨?。而食用菌液體菌種具有生產(chǎn)成本低、制作周期短、菌種品質(zhì)佳等優(yōu)點(diǎn)。早在1996年，張松曾進(jìn)行過羊肚菌液體菌種培養(yǎng)配方的初步研究，獲得菌絲球多，大小較均勻，質(zhì)量較高的液體菌種[36]。許瀛引等[37]則通過控制羊肚菌菌絲球的密度和直徑來提高菌絲體生物量，先模擬試驗(yàn)優(yōu)化羊肚菌液體菌種繁育條件，再通過發(fā)酵罐進(jìn)一步驗(yàn)證，制得優(yōu)質(zhì)的羊肚菌液體菌種，接種栽培后發(fā)現(xiàn)菌絲體生長健壯，菌絲滿袋天數(shù)較原固體菌種所需時(shí)間縮短了2/3，和現(xiàn)階段其他液體菌種制備方法相比縮短30%。這些研究奠定了羊肚菌液體菌種工廠化生產(chǎn)的技術(shù)基礎(chǔ)，也為液體菌種在栽培中的應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)羊肚菌菌絲體相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

3.2 食品開發(fā)

隨著現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌液體發(fā)酵物及產(chǎn)生的菌絲體都能保留其有效成分和香味。美國、法國等國在60年代已大規(guī)模生產(chǎn)菌絲體，制造調(diào)味品[38]，近年我國也有研究者通過復(fù)合酶法對呈鮮氨基酸進(jìn)行提取，有助于利用發(fā)酵技術(shù)制備羊肚菌鮮味物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)其高質(zhì)化利用[39]。關(guān)于羊肚菌風(fēng)味食品的研究，最早國內(nèi)宋淑敏曾使用羊肚菌在大豆汁、麥芽汁中發(fā)酵后制成保健飲料[40]。王秀云[41]將液體培養(yǎng)的羊肚菌菌種均勻噴灑在腐乳乳胚上，經(jīng)過發(fā)酵和腌制，得到了香味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富的羊肚菌腐乳。路等學(xué)等[42]將羊肚菌發(fā)酵液添加入其它食物中，制成具有特殊風(fēng)味的保健杏脯和保健話梅等。張青等[43]利用羊肚菌發(fā)酵菌絲體探討了羊肚菌保健酒的釀造工藝，獲得的羊肚菌保健酒色澤、風(fēng)味俱佳。冮潔等[44]則利用以豆渣為原料發(fā)酵產(chǎn)生的羊肚菌菌絲體，研制得到了醋酸含量達(dá)5.04 g/100 mL的羊肚菌菌絲體保健發(fā)酵醋。張珍將羊肚菌發(fā)酵液真空抽濾后加到乳飲料中，進(jìn)行二次調(diào)酸開發(fā)了營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的羊肚菌復(fù)合保健乳飲料[45]。付天宇以粗柄羊肚菌（Morchella crassipe）926號液態(tài)發(fā)酵得到的菌絲體為主要原料，分別制備了羊肚菌多糖口服液和羊肚菌調(diào)味料等新型功能性食品，研究了搖瓶發(fā)酵條件對羊肚菌調(diào)味料風(fēng)味的影響[46]。趙航等[47]利用羊肚菌液體發(fā)酵菌絲體代替子實(shí)體，制備出口感佳、營養(yǎng)豐富、可調(diào)味增香的羊肚菌調(diào)味醬。利用羊肚菌液態(tài)深層發(fā)酵開發(fā)研究功能性食品具有越來越廣闊的發(fā)展前景。

3.3 藥物研發(fā)

羊肚菌發(fā)酵液和菌絲體均含有多種藥用活性成分。宋淑敏等[48]曾將羊肚菌在麥芽汁、大豆汁中發(fā)酵提取液濃縮后制備成供糖尿病和膽固酵增高癥患者服用的藥物。楊英杰通過液體發(fā)酵以現(xiàn)代口含片生產(chǎn)技術(shù)研制出口感細(xì)膩、芳味獨(dú)特的羊肚菌和圓酵母雙菌口含片[49]。明建等[50]研究羊肚菌多糖PMEP-1對大鼠腸道短鏈脂肪酸的影響及降血脂作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMEP-1對高脂血癥的發(fā)生、動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病都有一定的預(yù)防作用，可用于新型降血脂類藥物的研制。羅霞等[51]和高明燕等[52]的研究發(fā)現(xiàn)尖頂羊肚菌菌絲體水提液可明顯降低胃黏膜損傷指數(shù)，增加胃黏液與胃蛋白酶的分泌，促進(jìn)胃潰瘍面積的愈合，對酒精引起的大鼠急性胃黏膜損傷起到很好的保護(hù)作用。賈建會等[53]的研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌發(fā)酵液既對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有直接刺激作用，還可協(xié)同刀豆蛋白A促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。近年研究還發(fā)現(xiàn)，羊肚菌發(fā)酵液菌絲體對各種營養(yǎng)素特別是鍺、硒、VE等具有較強(qiáng)的富集及轉(zhuǎn)化作用[54]。

國外研究人員曾從羊肚菌發(fā)酵液中分離得到了一種比阿司匹林效價(jià)要高出2～3倍的血小板集落抑制因子和一種可抑制酪氨酶的黑色素形成抑制劑[55-56]；Duncan等[57]分離到一種能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活化的半乳甘露聚糖；Nitha等則通過慶大霉素和順鉑聯(lián)用制備小鼠腎毒性模型，發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌絲體提取液，可顯著降低模型小鼠血清肌酐和尿素氮含量，提高小鼠谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）和超氧化物岐化酶（super oxide dismutase，SOD）的活性，對腎臟起到保護(hù)作用[58]。

但上述研究也僅初步發(fā)現(xiàn)羊肚菌發(fā)酵液的藥用價(jià)值，并不清楚是哪種生物活性物質(zhì)在發(fā)揮作用，為了更好地為人類所用，還需要進(jìn)一步研究。

3.4 發(fā)酵提取羊肚菌多糖

采用深層液體發(fā)酵法培養(yǎng)羊肚菌菌絲體具有明顯降低成本、提高生產(chǎn)效率等優(yōu)點(diǎn)。早期國內(nèi)賈建會等[59]曾探索過以羊肚菌液體深層發(fā)酵獲得的菌絲體和發(fā)酵液為原料提取、分離及純化羊肚菌多糖。后來蘭瑛[60]和李美華等[61]分別以尖頂羊肚菌和粗柄羊肚菌菌絲體為試驗(yàn)材料進(jìn)行胞外多糖的提取并對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。孫玉軍等[62]研究中性蛋白酶提取富硒羊肚菌菌絲體多糖提高產(chǎn)量的條件。He等[63]通過單因素試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)，得到制備羊肚菌多糖的液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基：麥芽糖44.79 g/L，胰蛋白酶原4.21 g/L。國外Taskin等[64]研究了雞毛蛋白水解物作為羊肚菌菌絲體生物量和胞外多糖液體發(fā)酵基質(zhì)的可行性，研究首次表明，雞毛蛋白水解物可以有效地作為一種新型的羊肚菌液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的基質(zhì)。

4 展望

現(xiàn)在對羊肚菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)多集中于液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化、菌絲體有效化學(xué)成分的研究、液體發(fā)酵菌絲體相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)等。通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件來獲得某種符合市場需求的目的性產(chǎn)物己成為一種有效途徑。羊肚菌菌絲體通過液體發(fā)酵培養(yǎng)來解決市場上野生羊肚菌資源不足和人工栽培周期長的問題，是羊肚菌的一大研究熱點(diǎn)。

未來研究應(yīng)繼續(xù)對羊肚菌液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，通過最優(yōu)的培養(yǎng)方式最大限度的獲得產(chǎn)品，篩選既可以滿足羊肚菌生長需求，且來源方便、價(jià)格便宜，大規(guī)模生產(chǎn)的培養(yǎng)基原料替代品。目前羊肚菌營養(yǎng)和活性成分在食品、化妝品、醫(yī)藥保健品等方面均有應(yīng)用，但起作用的生物活性成分并不清楚，并且大部分研究集中于羊肚菌多糖的生產(chǎn)和利用，在羊肚菌中還有可能存在著對人類更加有益或價(jià)值更高的化學(xué)成分有待發(fā)掘，所以也應(yīng)繼續(xù)深入研究羊肚菌活性成分及其功效，為羊肚菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。羊肚菌液體培養(yǎng)相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)多集中于保健品的開發(fā)，應(yīng)該還存在著很大的發(fā)展空間，如飼料等產(chǎn)品的研發(fā)，可使發(fā)酵液的剩余營養(yǎng)成分得到充分的利用，提高經(jīng)濟(jì)效益，也可減輕培養(yǎng)殘基對環(huán)境的污染，具有環(huán)保意義。

相信隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物學(xué)、發(fā)酵工程、食藥用真菌學(xué)等多領(lǐng)域?qū)W科的交叉滲透，羊肚菌發(fā)酵技術(shù)將會越來越完善，也會推動(dòng)整個(gè)羊肚菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。