魯興梅 ，于 越，郭 燕，李海龍 ，李志成 ，周迎霞 ，王宏偉

（1.甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州市人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

中醫(yī)臨床研究認(rèn)為肝癌的主要病因是“瘀毒內(nèi)盛”，中醫(yī)藥是通過“解毒散結(jié)”治療肝癌的[1]。黃芩為常用中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，其性寒、味苦，具有清熱燥濕，瀉火解毒”等功效。中醫(yī)古籍中有用黃芩配伍方劑“化瘤丹”“化瘤膏”醫(yī)治瘤、痼等病癥的記載?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芩可以提高腫瘤治療效果[2]。黃芩苷屬于黃酮類化合物，提取分離自中藥材黃芩干燥根，是黃芩最主要的有效成分[3]。本研究觀察黃芩苷對H22肝癌荷瘤小鼠瘤組織HMGB1、MMP2和MMP9表達(dá)的影響，探析黃芩苷對肝癌的可能作用機(jī)理，為臨床治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明小鼠 60只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，6～8 周齡，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（甘）2016—0007。小鼠每籠5只，雌雄分籠，空氣流通，噪音 ＜80～85 dB，濕度 45%～55%，溫度 20℃～25℃。標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由飲水和攝食。

1.2 細(xì)胞株

H22小鼠肝癌細(xì)胞株，上海和元生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥物

黃芪苷，南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司，提取來源：唇形科植物黃芪的干燥根，高效液相檢測純度≥98%；注射用環(huán)磷酰胺（安道生），美國百特國際有限公司生成，進(jìn)口藥品注冊證號(hào)：H20160467。

1.4 儀器與試劑

超凈工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司），CO2培養(yǎng)箱（力康公司），熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），羅氏9600熒光PCR儀（美國羅氏公司），胎牛血清（杭州四季青公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司），擴(kuò)增試劑盒（上海yeasen公司），一抗（美國IMMONOWAY公司），二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 荷瘤小鼠造模

按照王紅等的實(shí)驗(yàn)方法[4]，復(fù)蘇凍存H22小鼠肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)于10%胎牛血清與高糖DMEM，鏡下觀察，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時(shí)吹打成細(xì)胞懸液離心，無菌操作接種至小鼠腹腔，小鼠生長7 d后處死，無菌操作抽取腹水，離心收集細(xì)胞再重復(fù)連續(xù)體內(nèi)傳代兩次，最后收集細(xì)胞，用滅菌生理鹽水稀釋洗滌，調(diào)整細(xì)胞懸液為1×107/ml，取0.2 ml接種于小鼠右腋窩皮下，制成荷瘤小鼠模型。

2.2 分組及給藥

將60只小鼠隨機(jī)分為模型組、環(huán)磷酰胺陽性對照組（CTX組）、黃芩苷高劑量組（黃高組）、黃芩苷中劑量組（黃中組）、黃芩苷低劑量組（黃低組）、黃芩苷中劑量聯(lián)合環(huán)磷酰胺組（聯(lián)合組），每組10只。各組適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后造模，造模第3天開始給藥。模型組以10 ml/kg生理鹽水灌胃；CTX組以30 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔注射，黃高、中、低組分別以200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg黃芩苷灌胃，聯(lián)合組以100 mg/kg黃芩苷灌胃及30 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔注射，各組每日給藥一次，連續(xù)給藥14天。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 瘤重及抑瘤率 末次給藥完畢，各組小鼠禁食不禁水、過夜，以頸椎脫臼法處死，電子天平稱體重，完整剝離腫瘤組織稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（模型組瘤重量-給藥組瘤重量）÷模型組瘤重量×100%。每組5只小鼠瘤塊置于液氮等待實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，其余5只小鼠瘤塊以10%甲醛溶液固定。

2.3.2 MMP2和MMP9蛋白表達(dá) 各組瘤塊以石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟水化，3%去離子水滅活內(nèi)源性酶10 min，微波修復(fù)抗原5 min，間隔重復(fù)一次；依次滴加山羊血清、一抗、二抗；滴加SABC，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度脫水透明后封片，光學(xué)顯微鏡下每張切片取5個(gè)視野采集圖像，胞內(nèi)棕黃色顆粒為陽性著色，圖像分析軟件Image J測量光密度值，光密度值除以目標(biāo)分布區(qū)域的面積即平均光密度（Average Optical Density，AOD），以5個(gè)視野AOD平均值作為每張切片蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)。

2.3.3 HMGB1、MMP2和MMP9的mRNA表達(dá) 從液氮中取出瘤塊，稱取30 mg放入無RNA酶EP管中勻漿，加1 ml提取液靜置5 min，常規(guī)低溫抽提總RNA，加入DEPC水溶解，檢測RNA濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照擴(kuò)增試劑盒提供的條件，使用熒光定量PCR儀擴(kuò)增。95℃、10 s預(yù)變性，95℃、10 s，60℃、20 s，40 個(gè)循環(huán)分析融解曲線，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△CT法分析，以模型組為對照，以β-actin基因Ct均值為內(nèi)參組，目的基因相對表達(dá)量=2-△△CT。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 各組瘤重及抑瘤率比較

黃芩苷給藥后H22肝癌小鼠瘤組織生長受到抑制，黃芩苷3個(gè)劑量組瘤重量減輕呈劑量依賴性。與模型組相比，黃中組、黃高組和聯(lián)合組瘤重量顯著性減輕（P＜0.05或P＜0.01），抑瘤率以聯(lián)合組最高，結(jié)果見表2。

表2 各組瘤重和抑瘤率比較（±s）

表2 各組瘤重和抑瘤率比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

抑瘤率（%）0 38 65 62 50 67組別 體重（g）35.76±3.96 36.98±6.40 36.27±6.70 34.45±5.10 34.41±5.69 32.57±3.35模型組CTX組黃高組黃中組黃低組聯(lián)合組瘤重（g）5.50±3.34 3.42±2.52 1.91±1.47*2.08±1.54*2.75±2.93 1.80±0.92**

3.2 各組MMP2和MMP9蛋白表達(dá)比較

與模型組相比，黃芩苷給藥各組MMP2和MMP9蛋白著色較淺，為弱陽性或陰性，AOD下降（P＜0.05或 P＜0.01），結(jié)果見圖 1、圖 2、表 3。

圖1 各組腫瘤組織MMP2免疫組化染色（×400）

圖2 各組腫瘤組織MMP9免疫組化染色（×400）

表3 各組腫瘤組織MMP2和MMP9蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組腫瘤組織MMP2和MMP9蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 CTX組比較，#P＜0.05

模型組CTX組黃高組黃中組黃低組聯(lián)合組組別 MMP2（AOD）0.286±0.015 0.252±0.011**0.243±0.016**0.250±0.022*0.254±0.016*0.237±0.014**#模型組CTX組黃高組黃中組黃低組聯(lián)合組MMP9（AOD）0.342±0.058 0.277±0.012**0.270±0.013**0.267±0.020**0.296±0.010*0.263±0.021**

3.3 各組HMGB1、MMP2和MMP9 mRNA表達(dá)比較

與模型組相比，黃芩苷給藥后小鼠腫瘤組織HMGB1、MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)均有不同程度降低（P＜0.05或P＜0.01）；與 CTX組比較，黃高組和聯(lián)合組HMGB1、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)變化較為明顯（P＜0.01），結(jié)果見表4。

表4 各組腫瘤組織HMGB1、MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組腫瘤組織HMGB1、MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與CTX組比較，##P ＜0.01

模型組CTX組黃高組黃中組黃低組聯(lián)合組組別 MMP2（2-ΔΔCT）1.00±0.00 0.32±0.12**0.27±0.14**##0.35±0.18**0.44±0.15**##0.21±0.06**##模型組CTX組黃高組黃中組黃低組聯(lián)合組HMGB1（2-ΔΔCT）1.00±0.00 0.75±0.19*0.73±0.21**##0.76±0.11**0.78±0.05**##0.63±0.12**##MMMMP9（2-ΔΔCT）1.00±0.00 0.31±0.17**##0.25±0.12**##0.48±0.22**0.54±0.13**##0.29±0.10**##

4 討論

4.1 黃芩苷能抑制H22肝癌小鼠瘤組織生長

肝癌為常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率高，中醫(yī)藥在防治肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及改善中晚期患者癥狀、提高生存質(zhì)量、延長生存期等方面具有明顯優(yōu)勢，有必要選用中藥材及其提取物聯(lián)合治療肝癌[5]。黃芩是我國傳統(tǒng)中藥材，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黃芩及其提取物具有保肝作用，對肝炎、肝硬化和肝癌均有一定防治效果[6]。黃芩苷（Baicalin，BC）為黃芩提取物中最重要的活性成分，體外實(shí)驗(yàn)表明，黃芩苷能阻斷肝癌細(xì)胞周期變化、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞增殖[7]。臨床研究報(bào)道，原發(fā)性肝癌患者行肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)后連續(xù)口服黃芩苷膠囊90天，可改善癥狀、提高肝功能及療效[8]。除作為中藥單體抗肝癌之外，以黃芩苷為主要成分配伍的方劑也可阻斷肝癌進(jìn)展[9]。

本研究觀察黃芩苷高、中、低劑量給藥后對H22肝癌小鼠瘤組織生長情況的影響，結(jié)果顯示，各劑量組瘤重量減輕，呈劑量依賴性，與環(huán)磷酰胺聯(lián)合給藥抑瘤作用更加顯著。

4.2 黃芩苷能下調(diào)H22肝癌小鼠瘤組織HMGB1、MMP2和MMP9基因及蛋白表達(dá)

HMGB1來自遷移率族蛋白家族，是一種高度保守的染色體結(jié)合蛋白，因在電泳中有很高的遷移率而得名。HMGB1位于細(xì)胞核內(nèi)，主要參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與損傷修復(fù)；損傷、感染或化療時(shí)，轉(zhuǎn)錄后修飾的HMGB1可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)入分泌型溶酶體，使分泌型溶酶體與細(xì)胞膜融合并出胞，在炎癥和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[10]。在胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和胰腺癌等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)HMGB1高表達(dá)，其通過結(jié)合RAGE、Toll樣受體發(fā)揮多效生物學(xué)作用，促進(jìn)血管生成、組織浸潤和轉(zhuǎn)移[11-12]。內(nèi)源性HMGB1可調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬，并被認(rèn)為具有抗細(xì)胞凋亡的作用，抑制HMGB1表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并提高化療藥物的敏感性[13]。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族是一組參與基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)水解的酶，其家族重要成員Ⅳ型膠原酶在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要的水解蛋白作用[14]。Ⅳ型膠原酶包括MMP2和MMP9，MMP2、MMP9在肝癌中高表達(dá)，且MMP9與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系更為密切[15]。MMP9在肝癌中的表達(dá)與瘤體大小、瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期以及術(shù)后復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，MMP9表達(dá)陽性患者的生存期明顯短于陰性患者[16]。MMP2基因也能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移，其表達(dá)水平是診斷、治療肝癌及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)[17-18]。在肝癌細(xì)胞的侵襲遷移實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HMGB1調(diào)控MMP2和MMP9的表達(dá)，且HMGB1與MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)[19]。HMGB1與MMP9相關(guān)的可能機(jī)制為：受損細(xì)胞釋放HMGB1，HMGB1與其Toll樣受體結(jié)合，驅(qū)動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)并觸發(fā)細(xì)胞中MMP9表達(dá)上調(diào)[20]；HMGB1與纖溶酶原激活物結(jié)合，激活纖維蛋白溶酶，活化的纖維蛋白溶酶可激活MMP9，增強(qiáng)局部蛋白水解[21]。HMGB1還通過增強(qiáng)ERK1/2和NF-κB途徑、上調(diào)MMP2表達(dá)推動(dòng)肝癌發(fā)展[22]。

研究結(jié)果顯示，腫瘤組織HMGB1、MMP2和MMP9 mRNA表達(dá)下降，MMP2和MMP9蛋白表達(dá)也呈下降趨勢，表明黃芩苷可能通過下調(diào)HMGB1、MMP2和MMP9表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。