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        骨復(fù)生對激素性股骨頭壞死大鼠血清中VEGF、BALP、BGP表達的影響*

        2020-06-05 02:28:28王軍威劉德玉歐國峰袁普衛(wèi)王國柱YAROVABDULRAKHIM哈薩克斯坦
        陜西中醫(yī) 2020年5期
        關(guān)鍵詞:偶聯(lián)成骨造模

        王軍威 ,劉德玉,歐國峰,董 博 ,袁普衛(wèi) ,王國柱,肖 斌,陳 瑞,YAROV ABDULRAKHIM(哈薩克斯坦)

        1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712000);2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712000);3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科(咸陽 712046)

        激素性股骨頭壞死(Steroid-indueed avascular necrosis of the femoral head,SANFH)屬非創(chuàng)傷性股骨頭壞死,常見原因為股骨頸骨折、激素及酒精,屬骨壞死中最常見的一類,其致殘率極高,嚴重影響人們的生活質(zhì)量及水平[1-4]。祖國醫(yī)學(xué)認為股骨頭壞死屬“骨蝕”、“骨痿”等范疇,股骨頭部絡(luò)脈細微,氣血不足,外感六淫及內(nèi)生五邪引起骨絡(luò)不通,經(jīng)氣不得以上乘養(yǎng)筋骨,骨失津潤而致萎痹;反之經(jīng)絡(luò)運行暢通,氣血得以上乘,骨受氣血津潤,則經(jīng)絡(luò)通、骨萎痹除。成骨-成血管偶聯(lián)是指血管再生與骨生成這兩種生物學(xué)進程:由血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)軸調(diào)控的成骨-成血管偶聯(lián)來維持骨微環(huán)境的平衡,不管成骨還是成血管偶聯(lián)受損均可致骨的發(fā)育與重塑受限[5-7]。那么,骨復(fù)生是否通過影響成骨-成血管偶聯(lián)調(diào)控因子(BALP-VEGF-BGP) 對早中期激素性股骨頭壞死起到治療作用的,目前不得而知。因此,本研究擬通過動物實驗觀察骨復(fù)生對早中期激素性股骨頭壞死的可能作用機理及對血清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、骨堿性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,BALP)、骨鈣素(Bone Gla-protein,BGP)的影響,以期為中醫(yī)藥防治股骨頭壞死提供一定的理論依據(jù)。

        材料與方法

        1 動 物 160只4月齡普通級SD大鼠(雌雄各半),體重約在(280±40) g。所有動物均按中國動物實驗標準進行采購,由西安交大醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(陜)2017-004。

        2 藥 物 骨復(fù)生膠囊(規(guī)格:0.4 g×50粒,50粒/瓶,由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中成藥房提供)由鹿角膠15 g,三七6 g,蟲、牛膝、延胡索各12 g,黃芪30 g等組成;阿侖膦酸鈉片(福善美),國藥準字H10980109,石藥集團歐意藥業(yè)有限公司。

        3 主要試劑與儀器 甲潑尼龍琥珀酸鈉,國藥準字H20040845,國藥集團容生制藥有限公司;Mouse VEGF ELISA Kit(批號:2695R)、Anti-BALP Antibody(批號:RT201)、Anti-BGP(Osteocalcin) Antibody,脂多糖,北京索萊寶科技有限公司;超速低溫離心機,德國(Eppendorf);石蠟切片機,德國萊卡2135型;電子顯微鏡,日本(OLYMPUS)。

        4 造模及干預(yù)方法

        4.1 造模方法:建立早中期激素型股骨頭壞死模型,造模參照賀西京造模法[8]以及我們前期研究的方法[9]進行改良,中藥治療組、實驗對照組及模型組大鼠在喂養(yǎng)1周后給予尾靜脈注射脂多糖(50 μg/kg),連續(xù)注射3 d后每隔2日進行甲潑尼龍琥珀酸鈉(20 mg/kg)臀肌注射(統(tǒng)一從右側(cè)臀大肌以45度角勻速注射),隔日1次,連續(xù)注射8周后隨機抽取各組大鼠各2只進行股骨頭壞死模型鑒定,以股骨頭組織HE染色為參考,鏡下觀察其切片有空骨陷窩形成或骨細胞核聚集,伴有周圍骨髓細胞壞死征象,有1處壞死區(qū)域即可判斷造模成功[10]。

        4.2 治療方法:造模成功后,中藥治療組給予骨復(fù)生膠囊水溶液2 ml(約480 mg/ml)灌胃治療,實驗對照組則給予2 ml(約1.29 mg/ml)阿侖膦酸鈉片水溶液灌胃治療,模型組給予生理鹽水2 ml灌胃治療,每天1次,連續(xù)灌胃8周。正常不給予治療,正常飼養(yǎng)2周后處死取材。

        4.3 觀察指標及方法

        4.3.1 影像學(xué)檢查:隨機抽取20只大鼠(每組各5只),選取俯臥位,冠狀位,核磁共振(MRI)IR快速反轉(zhuǎn)序列掃描,觀察各組大鼠髖關(guān)節(jié)治療前后的影像學(xué)改變。

        4.3.2 組織病理學(xué)檢測:各組股骨頭標本(雙側(cè))沿股骨頭正中切開,固定24~48 h(4%多聚甲醛溶液)→脫鈣3~4周(10%EDTA)→包埋、切片、HE染色→觀察骨小梁結(jié)構(gòu)、骨細胞等的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化(電子顯微鏡)。

        4.3.3 血清骨代謝標志物(VEGF、BALP、BGP)表達情況:采用乙醚麻醉SD大鼠,待麻醉滿意后,用微量采血管從大鼠眼眶下靜脈叢處取血,將采血管置于低速離心機(4 ℃,3500 r/min)離心5 min后取得上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別對各組血清的相關(guān)骨代謝標志物進行檢測。

        5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以平均值±標準差表示,先以方差分析,若組間有差異,組間比較用q檢驗,方差不齊者采用秩和檢驗或者χ2檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 動物一般情況 空白組大鼠除了體重有所增加外,其他(精神狀況、毛發(fā)顏色等)均無明顯異常變化;模型組大鼠精神狀況比較差,毛發(fā)顏色晦暗并且沒有光澤,體重下降顯著,偶有毛發(fā)脫落等;中藥治療組、實驗對照組大鼠精神狀況尚可,毛發(fā)顏色較正常組稍差,體重輕微下降,但中藥組大鼠一般情況更接近于正常組。

        2 各組大鼠雙側(cè)髖關(guān)節(jié)MRI圖像變化 空白組未見明顯異常信號;模型組股骨頭出現(xiàn)中點狀或片狀樣中高等信號,周圍環(huán)繞不均勻低信號,呈典型雙線征,關(guān)節(jié)腔內(nèi)有少量積液;中藥治療組髖關(guān)節(jié)周圍偶有T2稍高信號,關(guān)節(jié)內(nèi)未見T2高信號,股骨頭形態(tài)規(guī)則,與軟骨界限分明;實驗對照組可見髖關(guān)節(jié)周少許T2高信號,關(guān)節(jié)內(nèi)偶有T2高信號,股骨頭形態(tài)尚規(guī)則,與軟骨界限大致分明(圖1)。

        圖1 各組髖關(guān)節(jié)(冠狀位)MRI掃描結(jié)果(白色箭頭所指為差異性表達區(qū)域)

        3 各組大鼠股骨頭HE染色后組織病理學(xué)改變空白組股骨頭軟骨厚度正常,軟骨細胞排列有序,結(jié)構(gòu)整齊;模型組股骨頭軟骨細胞大面積出現(xiàn)壞死,排列不整齊,軟骨細胞核聚縮,骨小梁內(nèi)骨細胞明顯減少,空骨陷窩明顯增多。中藥治療組股骨頭軟骨細胞排列尚規(guī)則,結(jié)構(gòu)尚完整,少有空骨陷窩,但實驗對照組多見,與正常組有較大差異(P<0.05)(圖2)。

        4 各組大鼠血清中VEGF、BALP、BGP含量表達情況 見表1。中藥治療組和實驗對照組在治療8周后與模型組相比血清中VEGF、BALP、BGP含量表達均升高,且中藥治療組在治療8周后VEGF、BALP、BGP含量比實驗對照組升高更顯著,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明骨復(fù)生與阿侖磷酸鈉能同時升高血清中VEGF、BALP、BGP含量來增強成骨細胞活性,促進VEGF發(fā)揮其成血管作用,促進BALP、BGP升高增加成骨細胞活性,提高骨代謝率,促進骨質(zhì)正常鈣化,隨著治療時間的延長,骨復(fù)生的療效更佳。

        圖2 各組動物股骨頭光鏡下HE染色結(jié)果(HE染色,×400)

        表1 各組大鼠血清中VEGF、BALP、BGP的含量表達情況

        注:與模型組比較,*P<0.05;與實驗對照組治療8周后比較,△P<0.05

        討 論

        激素性股骨頭壞死又屬股骨頭壞死中最常見的類型[11-13]。屬骨科三大疑難病之一,且明確診斷后未及時正確治療2年內(nèi)股骨頭塌陷率極高,而對于塌陷后的股骨頭及其臨床治療效果和預(yù)后均不甚理想[14]。如何正確選擇并進行早期的治療一直是骨科學(xué)術(shù)界的難題,早期診斷、選擇有效治療方法,如藥物的選擇或者保髖手術(shù)選擇,不僅可以減輕患者的臨床癥狀,延遲病程,還有治愈本病的可能,因此,本次研究具有重大意義。祖國醫(yī)學(xué)認為股骨頭壞死的局部表現(xiàn)是其全身性病變的一部分,患者存在全身性的改變,西醫(yī)治療本病以解決關(guān)節(jié)局部病變?yōu)橹鳎欢R床上患者體質(zhì)差異、基礎(chǔ)疾病不同,其病因病機也有一定差異,僅考慮局部癥狀,不改善全身狀況,是無法治愈股骨頭壞死的。祖國醫(yī)學(xué)在辨證論治的理念及整體觀念規(guī)范下,將患者的局部表現(xiàn)與全身狀況進行點到面的統(tǒng)籌分析,得出明確的“證”,隨后針對性的用方,進行整體、綜合性調(diào)節(jié),做到“標本兼治,多靶點作用”, 既能改善患者的整體狀況,又可以保留股骨頭,具有無法比擬的治療優(yōu)勢,大量的臨床及基礎(chǔ)研究資料也已證實其安全性和有效性[15-18]。目前,治療股骨頭壞死的中藥已達100種以上,因此,研究一組治療效率高、服用劑量小、使用方便、毒副作用底的特效中藥組合,勢在必行。

        “骨復(fù)生”是陜西省名中醫(yī)劉德玉教授經(jīng)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出來治療股骨頭壞死的經(jīng)驗方,本著以“補腎活血”為大法,已成為陜中附院的院內(nèi)治療多類股骨頭壞死并取得了顯著療效[19-21]的方法。方中三七和鹿角霜共為君藥,活血化瘀,補益肝腎;牛膝強壯筋骨,蟲破血化瘀,續(xù)筋接骨,共為佐藥,以增強君藥之補腎強筋、化瘀止痛之功效;黃芪補氣、當(dāng)歸補血,方藥組成合理,針對性強,能達補腎壯筋骨,促進骨愈合,防治骨壞死之功。成骨性細胞“成骨”、血管內(nèi)皮細胞“成血管”及VEGF軸對成骨性細胞和血管內(nèi)皮細胞的調(diào)控作用使之達到一個平衡來維持骨的發(fā)育與重建[22-26],由此我們推斷股骨頭壞死與成骨-成血管偶聯(lián)內(nèi)在之間存在某種對應(yīng)的聯(lián)系。

        通過本次實驗研究我們發(fā)現(xiàn)激素可同時降低SD大鼠血清中VEGF、BALP、BGP含量,影響股骨頭壞死組織的自身修復(fù),而骨復(fù)生能同時升高SANFH大鼠血清中VEGF、BALP、BGP表達的含量,增強成骨-成血管偶聯(lián)調(diào)控因子含量的表達,達成“成骨→活血生骨方→成血管”的微循環(huán)平衡,改善股骨頭局部血管內(nèi)環(huán)境[27-30],促進SD大鼠股骨頭壞死骨修復(fù)及股骨頭新生骨的生成,且隨著治療時間的延長作用越強。

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