王軍威 ，劉德玉，歐國(guó)峰，董 博 ，袁普衛(wèi) ，王國(guó)柱，肖 斌，陳 瑞，YAROV ABDULRAKHIM(哈薩克斯坦)

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712000)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽(yáng) 712000)；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科(咸陽(yáng) 712046)

激素性股骨頭壞死(Steroid-indueed avascular necrosis of the femoral head,SANFH)屬非創(chuàng)傷性股骨頭壞死，常見原因?yàn)楣晒穷i骨折、激素及酒精，屬骨壞死中最常見的一類，其致殘率極高，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量及水平[1-4]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為股骨頭壞死屬“骨蝕”、“骨痿”等范疇，股骨頭部絡(luò)脈細(xì)微，氣血不足，外感六淫及內(nèi)生五邪引起骨絡(luò)不通，經(jīng)氣不得以上乘養(yǎng)筋骨，骨失津潤(rùn)而致萎痹；反之經(jīng)絡(luò)運(yùn)行暢通，氣血得以上乘，骨受氣血津潤(rùn)，則經(jīng)絡(luò)通、骨萎痹除。成骨-成血管偶聯(lián)是指血管再生與骨生成這兩種生物學(xué)進(jìn)程：由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)軸調(diào)控的成骨-成血管偶聯(lián)來(lái)維持骨微環(huán)境的平衡，不管成骨還是成血管偶聯(lián)受損均可致骨的發(fā)育與重塑受限[5-7]。那么，骨復(fù)生是否通過(guò)影響成骨-成血管偶聯(lián)調(diào)控因子(BALP-VEGF-BGP) 對(duì)早中期激素性股骨頭壞死起到治療作用的，目前不得而知。因此，本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察骨復(fù)生對(duì)早中期激素性股骨頭壞死的可能作用機(jī)理及對(duì)血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、骨堿性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,BALP)、骨鈣素(Bone Gla-protein,BGP)的影響，以期為中醫(yī)藥防治股骨頭壞死提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

1 動(dòng) 物 160只4月齡普通級(jí)SD大鼠(雌雄各半)，體重約在(280±40) g。所有動(dòng)物均按中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采購(gòu)，由西安交大醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(陜)2017-004。

2 藥 物 骨復(fù)生膠囊(規(guī)格：0.4 g×50粒，50粒/瓶，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中成藥房提供)由鹿角膠15 g，三七6 g，蟲、牛膝、延胡索各12 g，黃芪30 g等組成；阿侖膦酸鈉片(福善美)，國(guó)藥準(zhǔn)字H10980109，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司。

3 主要試劑與儀器 甲潑尼龍琥珀酸鈉，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040845,國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司；Mouse VEGF ELISA Kit(批號(hào):2695R)、Anti-BALP Antibody(批號(hào):RT201)、Anti-BGP(Osteocalcin) Antibody，脂多糖，北京索萊寶科技有限公司；超速低溫離心機(jī),德國(guó)(Eppendorf)；石蠟切片機(jī),德國(guó)萊卡2135型；電子顯微鏡,日本(OLYMPUS)。

4 造模及干預(yù)方法

4.1 造模方法：建立早中期激素型股骨頭壞死模型，造模參照賀西京造模法[8]以及我們前期研究的方法[9]進(jìn)行改良，中藥治療組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及模型組大鼠在喂養(yǎng)1周后給予尾靜脈注射脂多糖(50 μg/kg)，連續(xù)注射3 d后每隔2日進(jìn)行甲潑尼龍琥珀酸鈉(20 mg/kg)臀肌注射(統(tǒng)一從右側(cè)臀大肌以45度角勻速注射)，隔日1次，連續(xù)注射8周后隨機(jī)抽取各組大鼠各2只進(jìn)行股骨頭壞死模型鑒定，以股骨頭組織HE染色為參考，鏡下觀察其切片有空骨陷窩形成或骨細(xì)胞核聚集，伴有周圍骨髓細(xì)胞壞死征象，有1處壞死區(qū)域即可判斷造模成功[10]。

4.2 治療方法：造模成功后，中藥治療組給予骨復(fù)生膠囊水溶液2 ml(約480 mg/ml)灌胃治療，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組則給予2 ml(約1.29 mg/ml)阿侖膦酸鈉片水溶液灌胃治療，模型組給予生理鹽水2 ml灌胃治療，每天1次，連續(xù)灌胃8周。正常不給予治療，正常飼養(yǎng)2周后處死取材。

4.3 觀察指標(biāo)及方法

4.3.1 影像學(xué)檢查:隨機(jī)抽取20只大鼠(每組各5只)，選取俯臥位，冠狀位，核磁共振(MRI)IR快速反轉(zhuǎn)序列掃描，觀察各組大鼠髖關(guān)節(jié)治療前后的影像學(xué)改變。

4.3.2 組織病理學(xué)檢測(cè):各組股骨頭標(biāo)本(雙側(cè))沿股骨頭正中切開，固定24～48 h(4%多聚甲醛溶液)→脫鈣3～4周(10%EDTA)→包埋、切片、HE染色→觀察骨小梁結(jié)構(gòu)、骨細(xì)胞等的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化(電子顯微鏡)。

4.3.3 血清骨代謝標(biāo)志物(VEGF、BALP、BGP)表達(dá)情況:采用乙醚麻醉SD大鼠，待麻醉滿意后，用微量采血管從大鼠眼眶下靜脈叢處取血，將采血管置于低速離心機(jī)(4 ℃，3500 r/min)離心5 min后取得上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別對(duì)各組血清的相關(guān)骨代謝標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先以方差分析，若組間有差異，組間比較用q檢驗(yàn)，方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)或者χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物一般情況 空白組大鼠除了體重有所增加外，其他(精神狀況、毛發(fā)顏色等)均無(wú)明顯異常變化；模型組大鼠精神狀況比較差，毛發(fā)顏色晦暗并且沒有光澤，體重下降顯著，偶有毛發(fā)脫落等；中藥治療組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠精神狀況尚可，毛發(fā)顏色較正常組稍差，體重輕微下降，但中藥組大鼠一般情況更接近于正常組。

2 各組大鼠雙側(cè)髖關(guān)節(jié)MRI圖像變化 空白組未見明顯異常信號(hào)；模型組股骨頭出現(xiàn)中點(diǎn)狀或片狀樣中高等信號(hào)，周圍環(huán)繞不均勻低信號(hào)，呈典型雙線征，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有少量積液；中藥治療組髖關(guān)節(jié)周圍偶有T2稍高信號(hào)，關(guān)節(jié)內(nèi)未見T2高信號(hào)，股骨頭形態(tài)規(guī)則，與軟骨界限分明；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組可見髖關(guān)節(jié)周少許T2高信號(hào)，關(guān)節(jié)內(nèi)偶有T2高信號(hào)，股骨頭形態(tài)尚規(guī)則，與軟骨界限大致分明(圖1)。

圖1 各組髖關(guān)節(jié)(冠狀位)MRI掃描結(jié)果(白色箭頭所指為差異性表達(dá)區(qū)域)

3 各組大鼠股骨頭HE染色后組織病理學(xué)改變空白組股骨頭軟骨厚度正常，軟骨細(xì)胞排列有序，結(jié)構(gòu)整齊；模型組股骨頭軟骨細(xì)胞大面積出現(xiàn)壞死，排列不整齊，軟骨細(xì)胞核聚縮，骨小梁內(nèi)骨細(xì)胞明顯減少，空骨陷窩明顯增多。中藥治療組股骨頭軟骨細(xì)胞排列尚規(guī)則，結(jié)構(gòu)尚完整，少有空骨陷窩，但實(shí)驗(yàn)對(duì)照組多見，與正常組有較大差異(P<0.05)(圖2)。

4 各組大鼠血清中VEGF、BALP、BGP含量表達(dá)情況 見表1。中藥治療組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組在治療8周后與模型組相比血清中VEGF、BALP、BGP含量表達(dá)均升高，且中藥治療組在治療8周后VEGF、BALP、BGP含量比實(shí)驗(yàn)對(duì)照組升高更顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明骨復(fù)生與阿侖磷酸鈉能同時(shí)升高血清中VEGF、BALP、BGP含量來(lái)增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)VEGF發(fā)揮其成血管作用，促進(jìn)BALP、BGP升高增加成骨細(xì)胞活性，提高骨代謝率，促進(jìn)骨質(zhì)正常鈣化，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，骨復(fù)生的療效更佳。

圖2 各組動(dòng)物股骨頭光鏡下HE染色結(jié)果(HE染色,×400)

表1 各組大鼠血清中VEGF、BALP、BGP的含量表達(dá)情況

注:與模型組比較,*P<0.05;與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組治療8周后比較,△P<0.05

討 論

激素性股骨頭壞死又屬股骨頭壞死中最常見的類型[11-13]。屬骨科三大疑難病之一，且明確診斷后未及時(shí)正確治療2年內(nèi)股骨頭塌陷率極高，而對(duì)于塌陷后的股骨頭及其臨床治療效果和預(yù)后均不甚理想[14]。如何正確選擇并進(jìn)行早期的治療一直是骨科學(xué)術(shù)界的難題，早期診斷、選擇有效治療方法，如藥物的選擇或者保髖手術(shù)選擇，不僅可以減輕患者的臨床癥狀，延遲病程，還有治愈本病的可能，因此，本次研究具有重大意義。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為股骨頭壞死的局部表現(xiàn)是其全身性病變的一部分，患者存在全身性的改變，西醫(yī)治療本病以解決關(guān)節(jié)局部病變?yōu)橹?，然而臨床上患者體質(zhì)差異、基礎(chǔ)疾病不同，其病因病機(jī)也有一定差異，僅考慮局部癥狀，不改善全身狀況，是無(wú)法治愈股骨頭壞死的。祖國(guó)醫(yī)學(xué)在辨證論治的理念及整體觀念規(guī)范下，將患者的局部表現(xiàn)與全身狀況進(jìn)行點(diǎn)到面的統(tǒng)籌分析，得出明確的“證”，隨后針對(duì)性的用方，進(jìn)行整體、綜合性調(diào)節(jié)，做到“標(biāo)本兼治，多靶點(diǎn)作用”， 既能改善患者的整體狀況，又可以保留股骨頭，具有無(wú)法比擬的治療優(yōu)勢(shì)，大量的臨床及基礎(chǔ)研究資料也已證實(shí)其安全性和有效性[15-18]。目前，治療股骨頭壞死的中藥已達(dá)100種以上，因此，研究一組治療效率高、服用劑量小、使用方便、毒副作用底的特效中藥組合，勢(shì)在必行。

“骨復(fù)生”是陜西省名中醫(yī)劉德玉教授經(jīng)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出來(lái)治療股骨頭壞死的經(jīng)驗(yàn)方，本著以“補(bǔ)腎活血”為大法，已成為陜中附院的院內(nèi)治療多類股骨頭壞死并取得了顯著療效[19-21]的方法。方中三七和鹿角霜共為君藥，活血化瘀，補(bǔ)益肝腎；牛膝強(qiáng)壯筋骨，蟲破血化瘀，續(xù)筋接骨，共為佐藥，以增強(qiáng)君藥之補(bǔ)腎強(qiáng)筋、化瘀止痛之功效；黃芪補(bǔ)氣、當(dāng)歸補(bǔ)血，方藥組成合理，針對(duì)性強(qiáng)，能達(dá)補(bǔ)腎壯筋骨，促進(jìn)骨愈合，防治骨壞死之功。成骨性細(xì)胞“成骨”、血管內(nèi)皮細(xì)胞“成血管”及VEGF軸對(duì)成骨性細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控作用使之達(dá)到一個(gè)平衡來(lái)維持骨的發(fā)育與重建[22-26]，由此我們推斷股骨頭壞死與成骨-成血管偶聯(lián)內(nèi)在之間存在某種對(duì)應(yīng)的聯(lián)系。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)研究我們發(fā)現(xiàn)激素可同時(shí)降低SD大鼠血清中VEGF、BALP、BGP含量，影響股骨頭壞死組織的自身修復(fù)，而骨復(fù)生能同時(shí)升高SANFH大鼠血清中VEGF、BALP、BGP表達(dá)的含量，增強(qiáng)成骨-成血管偶聯(lián)調(diào)控因子含量的表達(dá)，達(dá)成“成骨→活血生骨方→成血管”的微循環(huán)平衡，改善股骨頭局部血管內(nèi)環(huán)境[27-30]，促進(jìn)SD大鼠股骨頭壞死骨修復(fù)及股骨頭新生骨的生成，且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)作用越強(qiáng)。