黎 明 李 勇 黃 召 唐湘蓮 劉 贊 周宇翔 文佳冰 向強(qiáng)興

肝母細(xì)胞瘤(hepatoblastoma，HB) 是嬰幼兒最常見的胚胎源性肝臟腫瘤，多發(fā)生于3歲以下嬰幼兒，占兒童原發(fā)肝臟惡性腫瘤的80%[1]。該病發(fā)展迅速，瘤體生長迅速，惡性程度高，易發(fā)生浸潤和侵襲轉(zhuǎn)移，目前多采用手術(shù)聯(lián)合化療的多學(xué)科綜合治療方案[2]。由于術(shù)后殘留、復(fù)發(fā)，對(duì)化療藥物的不耐受及耐藥性等問題一直未得到有效解決，因此尋找安全、低毒的化療藥物是目前國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一[3]。目前有關(guān)PI3K激酶小分子抑制劑的研究已經(jīng)成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，但是有關(guān)靶向亞型的小分子抑制劑對(duì)肝母細(xì)胞瘤效應(yīng)的研究較少。因此，本研究將采用新型的小分子抑制劑Serabelisib，通過靶向PI3K/Akt信號(hào)通路，探討其對(duì)于肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡的作用，同時(shí)檢測相關(guān)的分子機(jī)制，為肝母細(xì)胞瘤的治療尋找新的藥物和途徑，并為Serabelisib治療肝母細(xì)胞瘤的臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞系與試劑

人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2由本實(shí)驗(yàn)室保存[4]。Serabelisib、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 購自美國Selleck公司；胎牛血清購自美國Gibco 公司； DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶購自美國HyClone 公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自美國Sigma公司，PBS緩沖液配制成5 mg/mL儲(chǔ)存液，0.22 μM濾膜過濾除菌，分裝后于-20℃避光保存；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit購自聯(lián)科生物公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司； 針對(duì)89KD PARP裂解片段的cleaved-PARP抗體、Akt抗體及p-Akt抗體購自美國Cell Signaling公司；β-Actin 抗體購自美國Santa Cruz公司；SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate trial kit(34079)購自美國Thermo公司。顯影劑、定影劑和X 光片均購自日本柯達(dá)公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)及Serabelisib的配制

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。Serabelisib先用DMSO配成原液，分裝凍存，臨用時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，DMSO終濃度為0.1%。

(二) MTT 比色法

調(diào)整處于對(duì)數(shù)期細(xì)胞懸液的濃度，將HepG2細(xì)胞接種在96孔板上(每孔100 μL)，12 h后加入不同濃度Serabelisib并處理不同時(shí)間； 加入MTT(每孔10 μL)，37℃、5% CO2培養(yǎng)4 h；1 800 rpm離心5 min，小心棄上清，加入DMSO溶解各孔MTT代謝產(chǎn)物，酶標(biāo)儀內(nèi)震蕩孵育10 min，檢測492 nm波長下吸光度值(A)。細(xì)胞生長抑制率(%)=[1-(處理組A均值/對(duì)照組A均值)]×100%；細(xì)胞活性(%)=(處理組A均值/對(duì)照組A均值)×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

(三)細(xì)胞凋亡測定

將HepG2細(xì)胞接種在6孔板上，12 h后加入不同濃度Serabelisib處理48 h后，使用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。收集細(xì)胞于離心管中，1 000 rpm離心5 min，加入500 μL 1×結(jié)合緩沖液、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI 混勻，避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，使用Cellquest軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

(四)Western blot檢測相關(guān)蛋白

HepG2細(xì)胞以不同濃度Serabelisib處理48 h后，以蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取上清液即為總蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。99℃、10 min加熱變性后，進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移置PVDF膜上，封閉、孵育一抗、二抗，X光片曝光、顯影、定影顯示目標(biāo)條帶。使用NIH ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行密度分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、 Serabelisib對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

為證實(shí)小分子抑制劑Serabelisib對(duì)人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的抑制作用，以不同濃度Serabelisib(0 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L)處理人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞24 h、48 h、72 h，以MTT法檢測細(xì)胞活性，并計(jì)算細(xì)胞生存率。結(jié)果顯示隨著濃度的升高，Serabelisib對(duì)于細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，且抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性(圖1)。

二、Serabelisib對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度Serabelisib(0 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L)處理人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞48 h后，以Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率。發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞早期和晚期凋亡率均隨Serabelisib濃度增加而增加，呈明顯劑量依賴性(圖2)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值和標(biāo)準(zhǔn)差。細(xì)胞凋亡趨勢與MTT結(jié)果相一致。提示Serabelisib對(duì)人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有抑制作用，可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

圖1 Serabelisib抑制人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖。HepG2細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔種植于96孔板，不同濃度Serabelisib(0 μmol/L,2 μmol/L,4 μmol/L,8 μmol/L)處理不同時(shí)間(24 h，48 h，72 h)后，以MTT法檢測細(xì)胞活性。平行3孔，柱狀圖表示生存率和標(biāo)準(zhǔn)差。*表示與對(duì)照組(0 μmol/L)相比P<0.05

Fig.1 Serabelisib inhibited cellular growth of human hepatoblastoma cell lines

三、Serabelisib抑制HepG2細(xì)胞中Akt磷酸化及促進(jìn)PARP的裂解

Akt的本質(zhì)是大小為56kD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，處于PI3-K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心部位。Akt在PI3-K等作用下發(fā)生磷酸化后充分活化，其磷酸化水平反映信號(hào)通路活化水平。PARP (polyADP-ribose polymerase)是一種DNA修復(fù)酶，為Caspase的催化底物，可被催化為89KD和24KD的裂解產(chǎn)物而失活，其裂解片段是細(xì)胞凋亡的分子標(biāo)志之一。為進(jìn)一步證明Serabelisib可以抑制PI3K-Akt信號(hào)通路并且誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，我們用Western印跡檢測了Serabelisib作用下HepG2細(xì)胞株Akt蛋白磷酸化水平及PARP裂解產(chǎn)物水平的變化。結(jié)果顯示，Serabelisib抑制Akt激酶磷酸化水平存在劑量依賴性，提示該小分子抑制劑可以抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性；而PARP 89KD裂解片段隨Serabelisib濃度增加而增加，呈劑量依賴性(圖3)。

討 論

肝母細(xì)胞瘤(hepatoblastoma，HB) 是嬰幼兒最常見的胚胎源性肝臟腫瘤，其主要形成機(jī)制是在胚胎發(fā)育期間，由肝臟內(nèi)的多能干細(xì)胞分化增殖產(chǎn)生惡性腫瘤細(xì)胞，多發(fā)生于3 歲以下嬰幼兒，占兒童原發(fā)肝臟惡性腫瘤的80%[1,2]。目前的治療手段主要是手術(shù)聯(lián)合化療。HB治愈率在80%左右，而剩余20%的侵襲性更強(qiáng)的腫瘤對(duì)化療基本沒有反應(yīng)，這些患者的預(yù)后很差，但是由于術(shù)后殘留、復(fù)發(fā)，患者對(duì)化療藥物的不耐受及耐藥性等負(fù)面效應(yīng)一直存在[3,5]。

圖2 Serabelisib誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞系凋亡，呈明顯劑量依賴性 注 A:HepG2細(xì)胞以不同濃度Serabelisib處理48 h后，Annexin V和PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。本組圖片為其中1次檢測結(jié)果，分別標(biāo)識(shí)早期凋亡(Annexin V-FITC+/PI-)和晚期凋亡(Annexin V+/P+)和完全壞死細(xì)胞(Annexin V-FITC-/PI+)比例; B:柱狀圖表示早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞總比例，為3次實(shí)驗(yàn)平均值，bar表示標(biāo)準(zhǔn)差。*表示與對(duì)照(0 μmol/L)相比P<0.05

Fig.2 The apoptosis of HepG2 cell line was induced by Serabelisib in a dose-dependent manner

圖3 Serabelisib抑制人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路活性及促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 注 A:HepG2細(xì)胞以不同濃度Serabelisib(0 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L)處理48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測p-Akt、T-Akt 及PARP 89KD裂解產(chǎn)物，以β-actin作為上樣量參照。條帶使用ImageJ軟件進(jìn)行掃描并分析; B:采用NIH ImageJ軟件分析各條帶灰度值，并與β-actin進(jìn)行比較

Fig.3 Serabelisib inhibited the activity of PI3K/Akt signaling pathway and promoted the expression of apoptosis-related proteins in HepG2 cells

目前HB的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，除了腫瘤遺傳學(xué)事件的發(fā)生，肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移同樣離不開環(huán)境中的各種生物信號(hào)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常也被認(rèn)為是肝母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制之一。近期研究表明，PI3K-Akt通路是一個(gè)經(jīng)典的促增殖、抑凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)血管生成，抵抗化療和放療中細(xì)胞的凋亡上均發(fā)揮重要作用，該信號(hào)通路的所有成員(包括Akt)被認(rèn)為是單一治療或聯(lián)合治療的靶點(diǎn)用于治療各種癌癥，阻斷PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常活化成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[6-10]。

凋亡是細(xì)胞程序化死亡的過程，發(fā)生在細(xì)胞老化過程中，在正常組織的動(dòng)態(tài)平衡和發(fā)育中起著重要作用[11]。細(xì)胞凋亡是一種重要的抗腫瘤途徑，多種抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在腫瘤中發(fā)揮重要作用，在癌變過程中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為能有效減緩癌癥的進(jìn)展[12,13]。PARP(polyADP-ribose polymerase)是一種DNA修復(fù)酶，為Caspase的催化底物，可被催化為89KD和24KD的裂解產(chǎn)物而失活，其裂解片段也是細(xì)胞凋亡的分子標(biāo)志之一[14]。Akt是大小為56kD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，處于PI3-K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心部位。Akt在PI3-K等作用下發(fā)生磷酸化后充分活化，其磷酸化水平反映了信號(hào)通路活化水平[15]。細(xì)胞凋亡的激活受多種信號(hào)通路的調(diào)控，其中PI3K/AKT通路是最重要的信號(hào)通路之一[16]。

研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路異常活化在肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[17,18]。有研究表明肝母細(xì)胞瘤中存在PI3Kα亞基突變，從而導(dǎo)致激酶活性增加。通過 PI3K體外抑制和隨后的Akt和GSK3β磷酸化的減少證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路的異?；罨歉文讣?xì)胞瘤細(xì)胞存活的關(guān)鍵[17]。

Serabelisib(INK-1117，mLN-1117，TAK-117)是一種新型的、有效的、具有高度選擇性并且可采用口服的PI3Kα抑制劑[19]。Serabelisib可有效抑制PI3Kα的活性，其選擇性比其他Ⅰ類PI3K家族成員高100倍以上。對(duì)攜帶有PIK3α突變的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行Serabelisib處理，細(xì)胞內(nèi)PI3K信號(hào)通路被有效抑制，細(xì)胞增殖阻滯并引起細(xì)胞凋亡，并且有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制胞內(nèi)Akt的磷酸化和活性。Serabelisib單用或者與其他抑制劑聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)在非血液系統(tǒng)惡性腫瘤、胃癌、乳腺癌、腎腫瘤及非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的實(shí)體瘤中進(jìn)行了體外及臨床研究，療效得到了肯定[9,19,20]。

目前PI3K激酶小分子抑制劑的研究已經(jīng)成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，但是靶向亞型的小分子抑制劑對(duì)于肝母細(xì)胞瘤效應(yīng)的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，PI3Kα特異性的小分子抑制劑Serabelisib可以抑制肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并呈劑量依賴性，其分子機(jī)制涉及到抑制PI3K/Akt信號(hào)通路及PARP的裂解失活；后續(xù)我們將在其他HB細(xì)胞系及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該小分子抑制劑的作用，為Serabelisib用于肝母細(xì)胞瘤治療的臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。