汪 雷 胡火軍 馬金陽(yáng) 董元訓(xùn) 黃 松 符常濤 袁 高 周有東

腦血管病病人繼發(fā)腦功能障礙往往是神經(jīng)元凋亡和腦微循環(huán)損傷的結(jié)果[1]。靜脈纖溶酶原激活劑是治療急性缺血性腦卒中唯一有效的藥物[2]，但治療時(shí)間窗短，還有潛在的出血風(fēng)險(xiǎn)，只有一小部分病人獲益[3]。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種多酚類(lèi)植物抗毒素，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及抗癌作用，能透過(guò)血腦屏障并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4，5]。有研究報(bào)道Res 可以通過(guò)介導(dǎo)磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，PKB 或Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]。本研究通過(guò)建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞缺血后再灌注模型，探討Res 對(duì)大鼠腦缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，Res和3-MA均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PCR試劑盒購(gòu)自南京Vazyme 公司。兔多抗mTOR 及PmTOR（289 KD）購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences 公司，兔單抗Akt 及P-Akt（60 KD）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司，鼠單抗PI3K（85 KD）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔多抗p-PI3K（85KD）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，兔多抗GAPDH（37 KD）購(gòu)自杭州賢至生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，7周齡，體重（250±30）g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證編號(hào)：SCXK 鄂2016-0004）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、Res組和Res+PI3K 抑制劑組，每組20只。

1.3 模型建立和干預(yù) 參照Yanamoto等[7]報(bào)道的線(xiàn)栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞模型，缺血2 h，再灌注24 h。造模前6 d，Res 組和Res+PI3K 抑制劑組腹腔注射Res（15 μg/g，1次/d），假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水；造模前30 min，Res 組和Res+PI3K抑制劑組先腹腔注射Res（15 μg/g），然后，Res+PI3K組用微量注射器向右側(cè)腦室（前囟點(diǎn)旁開(kāi)1.6 mm，向后0.9 mm，腔深3.8mm）注射PI3K 抑制劑3-MA 5 μl（50 μg），假手術(shù)組和模型組右側(cè)腦室注射等體積生理鹽水。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)估 造模后21 h，采用Zea Longa評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能[8]。

1.5 腦梗死體積的評(píng)估 造模后24 h，每組隨機(jī)選取4 只大鼠行TTC 染色評(píng)估腦梗死體積。麻醉處死大鼠后，取鼠腦置于-20度冰箱冷凍20 min后，取出切片，層厚2 mm[9]。然后，將腦片置于2%TTC 溶液中孵育，完全顯色后將其移入4%多聚甲醛中過(guò)夜固定后拍片。為避免因腦水腫產(chǎn)生數(shù)據(jù)誤差，我們采用梗死面積比[（對(duì)側(cè)半球面積-患側(cè)正常腦組織面積）/對(duì)側(cè)半球面積]描述腦梗死程度。

1.6 尼氏染色觀(guān)察腦組織尼氏體形態(tài) 術(shù)后24 h，每組隨機(jī)選取4 只大鼠以10%水合氯醛麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛行心臟灌注和組織固定，然后取鼠腦置于4%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)石蠟包埋、組織切片、脫蠟后，再行1%的甲苯胺藍(lán)染色，95%酒精快速分化，脫色，無(wú)水乙醇快速脫水，二甲苯透明，尼氏染色，顯微鏡下觀(guān)察。

1.7 透射電子顯微鏡觀(guān)察自噬體形態(tài) 術(shù)后24 h，每組隨機(jī)選取4 只大鼠以10%水合氯醛麻醉，采用0.9%生理鹽水250 ml 心臟灌注后，再用4%多聚甲醛+2.5%戊二醛混合液250ml 快速灌注固定，然后，快速分離右側(cè)半球額頂區(qū)皮質(zhì)，大小約1 mm3，以預(yù)冷的2%多聚甲醛和2.5%戍二醛的PBS 混合液4 ℃固定過(guò)夜。再用四氧化鋨固定1 h，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片（厚度100 nm），并用乙酸鈾和檸檬酸鉛染色，最后在透射電子顯微鏡下觀(guān)察。

1.8 PCR 檢測(cè)腦組織自噬及凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平設(shè)計(jì)并合成大鼠Beclin1及GAPDH基因（內(nèi)參照）的PCR引物。術(shù)后24 h，每組隨機(jī)選取4只大鼠并收集腦缺血周邊區(qū)組織約50 mg，分別提取其總RNA 并予以定量檢測(cè)。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京Vazyme公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按其試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行PCR 檢測(cè)，以2-ΔΔCt法進(jìn)行量化分析。beclin1正義鏈5'-GAGGTACCGACTTGTTCCCT-3'，反義鏈5'-CCTTTCTCCACGTCCATCCT-3'。內(nèi)參GAPDH 正義鏈5'- ACAGCAACAGGGTGGTGGAC- 3'，5'- TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

1.9 免疫印跡法檢測(cè)mTOR、PI3K、Akt及相應(yīng)磷酸化水平 術(shù)后24 h，每組隨機(jī)選取4 只大鼠并分離腦缺血周邊區(qū)組織，提取各組織總蛋白，SDS-PAGE分離各蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將Akt（1:1 000），p-Akt（1:2 000），PI3K（1:4 000），p-PI3K（1:600），mTOR（1:1 000），p-mTOR（1:1 000）相應(yīng)一抗分別放入封閉液（5%的脫脂奶粉的TBST 溶液）中，4°C 孵育過(guò)夜，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1:50 000），室溫孵2h,最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色，以GAPDH作內(nèi)參。1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0 進(jìn)行分析；定量數(shù)據(jù)以±s 表示，用單因素方差分析；P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 模型組Zea Longa評(píng)分[（3.09±0.19）分]明顯高于假手術(shù)組[（0.19±0.16）分；P＜0.05]；與模型組比較，Res 組Zea Longa 評(píng)分[（1.95±0.24）分]和Res+PI3K 抑制劑組Zea Longa 評(píng)分[（2.66±0.22）分]均明顯降低（PP＜0.05），而Res 組和Res+PI3K 抑制劑組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 假手術(shù)組大鼠腦組織未見(jiàn)梗死灶；模型組、Res組和Res+PI3K抑制劑組大鼠右側(cè)大腦半球皮層和皮層下可見(jiàn)明顯白色梗死灶，左側(cè)大腦半球腦組織呈正常紅色。Res 組和Res+PI3K 抑制劑組腦梗死體積均明顯小于模型組（P＜0.05），而且Res+PI3K 抑制劑組腦梗死體積較Res組明顯增大（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.3 各組腦組織尼氏體形態(tài)比較 與假手術(shù)組相比，模型組尼氏體明顯減少，而且染色加深，形狀不規(guī)則。與模型組比較，Res 組和Res+PI3K 抑制劑組尼氏體數(shù)量則明顯增加；與Res組比較，Res+PI3K抑制劑組尼氏體數(shù)量則相對(duì)減少。見(jiàn)圖2。

2.4 各組腦組織自噬體形態(tài)比較 假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞質(zhì)中線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯自噬泡；模型組可見(jiàn)明顯細(xì)胞核固縮、碎裂、深染，胞膜輪廓不清，胞質(zhì)疏松，可見(jiàn)大量空泡和液化灶，同時(shí)可見(jiàn)線(xiàn)粒體腫脹變形，線(xiàn)粒體嵴斷裂；Res 組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、和雙層膜自噬體等；Res+PI3K抑制劑組可見(jiàn)少量自噬體和其他細(xì)胞器。見(jiàn)圖3。

2.5 各組腦組織自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組Beclin1 mRNA 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，Res組和Res+PI3K抑制劑組Beclin1 mRNA 水平明顯增高（P＜0.05）；與Res 組相比，Res+PI3K抑制劑組Beclin1 mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.6 各組腦組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及其磷酸化水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組PI3K、mTOR和Akt蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），而各自蛋白磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）；相比于模型組，Res 組和Res+PI3K 抑制劑組PI3K、mTOR 和Akt 蛋白磷酸化水平明顯下降（P＜0.05）；和Res 組相比，Res+PI3K抑制劑組PI3K、mTOR和Akt蛋白磷酸化水平明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

本研究探討Res 對(duì)大鼠腦I/R 損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Res 可明顯改善腦I/R 損傷大鼠的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的自消化途徑，負(fù)責(zé)清除長(zhǎng)壽蛋白、受損的細(xì)胞器和在溶酶體生物合成中形成的畸形蛋白[10]。自噬是真核細(xì)胞降解和再循環(huán)胞質(zhì)內(nèi)容物的主要細(xì)胞保護(hù)途徑，對(duì)機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)起著重要的作用，適度的自噬可抑制炎癥及凋亡[11]。生理?xiàng)l件下，自噬被觸發(fā)以維持體內(nèi)平衡功能，并在營(yíng)養(yǎng)缺乏或應(yīng)激（如I/R損傷）時(shí)上調(diào)，以提供氨基酸和產(chǎn)生能量。在病理生理?xiàng)l件下，自噬功能障礙的特點(diǎn)是不能清除受損的細(xì)胞器或碎片[12]。對(duì)I/R損傷后組織自噬的研究表明，受損線(xiàn)粒體的累積導(dǎo)致活性氧生成增加，促進(jìn)細(xì)胞壞死和組織損傷[13]。因此，改善腦組織對(duì)I/R損傷的自噬反應(yīng)可以降低細(xì)胞凋亡和壞死水平，保護(hù)組織功能。

PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是促進(jìn)缺血神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和生存的重要信號(hào)通路，而且與細(xì)胞自噬的激活緊密相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Res組大鼠神經(jīng)元內(nèi)可觀(guān)察到自噬體，同時(shí)Res 組大鼠腦內(nèi)自噬相關(guān)基因Beclin1 mRNA 表達(dá)水平也明顯增高，表明Res 通過(guò)促進(jìn)腦I/R 誘導(dǎo)的自噬水平，從而促進(jìn)神經(jīng)元存活；免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示Res 能顯著下調(diào)腦I/R 損傷大鼠腦組織p-PI3K、p-Akt、p-MTOR 水平，而PI3K 抑制劑3-MA 能夠削弱Res 的作用。這表明Res 的自噬促進(jìn)作用可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，Res 可以改善大鼠腦組織I/R 損傷，可能與下調(diào)PI3K、Akt、mTOR等蛋白磷酸化水平、抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路、調(diào)控細(xì)胞自噬水平有關(guān)。