于 湛, 韓東旭, 李昊原, 辛士剛, 張洪波

(1. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034; 2. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 沈陽(yáng) 110034)

0 引 言

環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)是以包含6個(gè)(α-)、7個(gè)(β-)或8個(gè)(γ-)吡喃葡萄糖為基本結(jié)構(gòu)單元,并由α-1,4糖苷鍵鏈接而成的環(huán)狀寡糖[1]。環(huán)糊精具有“內(nèi)腔疏水,外部親水”的特性,外形呈現(xiàn)上窄下寬、兩端開(kāi)口的中空結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。正是由于具有上述結(jié)構(gòu)特點(diǎn),CD可作為主體與多種無(wú)機(jī)或有機(jī)小分子化合物形成復(fù)合物[2]。天然CD特別是β-CD由于具有較強(qiáng)的分子內(nèi)氫鍵作用,因此在水中溶解度很小。CD的2-、3-或6-羥基具有一定化學(xué)活性,可在一定條件下被其他官能團(tuán)所取代,生成諸如七-(2,6-二甲基)-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)、七-(2-羥丙基)-β-環(huán)糊精(2HP-β-CD)與6-葡萄糖基-β-環(huán)糊精(6Glu-β-CD)等CD衍生物。這些CD衍生物在保留了空腔疏水性的前提下,極大地提高了溶解度與選擇性,因此具有良好的應(yīng)用前景[3-6]。

喜樹(shù)堿(camptothecin,CPT)是一種由珙桐科植物喜樹(shù)的果實(shí)或根莖表皮中提取的細(xì)胞毒性喹啉類(lèi)生物堿。CPT是被用于早期中醫(yī)治療癌癥的一種藥物,由于其對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I具有抑制作用[7],成為早期唯一的一種能夠作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抗腫瘤藥物。由于具有抗腫瘤的功效,CPT廣泛應(yīng)用于直腸癌、腸癌、胃癌和白血病等疾病的治療[8],同時(shí)也有一定的副作用,例如嘔吐、腹瀉[9]及血性膀胱炎等[10]。盡管CPT具有很好的藥用前景,但是由于其結(jié)構(gòu)中親水性極性基團(tuán)數(shù)量較少,在水中的溶解度較低,口服后在人體內(nèi)的吸收利用率不高。

CD可通過(guò)與難溶性小分子藥物形成復(fù)合物的方式有效提高藥物的溶解度[11]。為了提高CPT水溶性,使其能更好地被生物體吸收,本文使用α-CD、β-CD、γ-CD、2HP-β-CD、DM-β-CD與6Glu-β-CD等6種CD作為增溶劑,研究它們對(duì)CPT的增溶作用,并通過(guò)分子模擬計(jì)算推測(cè)了增溶機(jī)理。

圖1 文中所用CD(A)與CPT(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of CDs (A) and CPT (B) used in this work

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀(NICOLET 380,美國(guó)賽默飛),紫外-可見(jiàn)光譜儀(UH5300,日本日立),高速離心機(jī)(CT6TA,中國(guó)天美)。

CPT購(gòu)買(mǎi)于西安開(kāi)來(lái)生物制藥有限公司,α-CD、β-CD、γ-CD、DM-β-CD、2HP-β-CD和6Glu-β-CD均來(lái)自上海源葉生物科技有限公司,本文所使用的溶劑均為分析純或更高,實(shí)驗(yàn)用水為超純水(25 ℃時(shí)電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 相溶解度法

準(zhǔn)確配制50 mL濃度為0.1 mol/L的CD標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。準(zhǔn)確稱(chēng)量6份質(zhì)量相同的CPT于15 mL離心管中,每份質(zhì)量為0.001 0 g,再分別向這6支離心管中加入一定體積CD儲(chǔ)液并用水稀釋至10.0 mL,使其中CD濃度分別達(dá)到0、2.0×10-4、4.0×10-4、6.0×10-4、8.0×10-4和1.0×10-3mol/L。將上述樣品在室溫下用連續(xù)超聲30 min后在3 000 rpm條件下離心10 min,取上層清液通過(guò)0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾,然后使用紫外-可見(jiàn)光譜分析。

1.2.2 傅里葉變換紅外光譜法

以DM-β-CD為例。將CPT、DM-β-CD、DM-β-CD/CPT物理混合物(摩爾比1∶1,研磨30 s)、DM-β-CD/CPT復(fù)合物(摩爾比1∶1,研磨30 min)干燥備用。分別取上述4種樣品與KBr按1∶100混合于瑪瑙研體中,在紅外光燈下混合研磨均勻后壓片,在波數(shù)400～4 000 cm-1范圍內(nèi)檢測(cè)其紅外吸收。

1.2.3 分子模擬計(jì)算

α-CD(編號(hào):BAJJAX)、β-CD(編號(hào):ARUXIU)、γ-CD(編號(hào):CYDXPL)的三維結(jié)構(gòu)均來(lái)自于劍橋晶體數(shù)據(jù)庫(kù)。DM-β-CD、2HP-β-CD與6Glu-β-CD等β-CD衍生物結(jié)構(gòu)是基于β-CD結(jié)構(gòu)使用PyMol軟件自行繪制獲得的。CPT結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來(lái)自PubChem網(wǎng)站。CPT與所有CD分子在進(jìn)行分子模擬計(jì)算前,均使用MMFF94方法[12]進(jìn)行預(yù)處理。

本文使用Autodock 4.2軟件包進(jìn)行主客體對(duì)接模擬[13]。主客體分子均依照Autodock系統(tǒng)程序默認(rèn)值進(jìn)行處理,未改變單鍵的自由度、非極性氫原子等。分子對(duì)接選擇在一個(gè)126 ?×126 ?×126 ?的立方體格子中進(jìn)行,格子間隔為默認(rèn)值0.375 ?,對(duì)接計(jì)算采用的是拉馬克遺傳算法(LGA)。為了使每次計(jì)算更為充分,以便獲得更為準(zhǔn)確的計(jì)算結(jié)果,本文采用較大的運(yùn)算參數(shù)以提高對(duì)接計(jì)算量,部分參數(shù)設(shè)置為:最大能量評(píng)估值(ga_num_evals)增加至2 500 000,種群數(shù)(ga_pop_size)提高至150,循環(huán)計(jì)算次數(shù)(ga_run)提高至300。

本文利用半經(jīng)驗(yàn)量子化學(xué)計(jì)算軟件MOPAC 2016(V17.279L)對(duì)分子對(duì)接所獲得的結(jié)果在半經(jīng)驗(yàn)水平進(jìn)行量子化學(xué)計(jì)算[14],以便于探究復(fù)合物形成前后CPT與CD能量變化情況。分別采用PM6-D3H4和PM7方法進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算參數(shù)還包括XYZ、PRECISE、EF及GNOME=0.1,溫度為298.15 K。

復(fù)合物的復(fù)合能ΔEcomplexation依照下述公式計(jì)算[15-16]:

ΔEcomplexation=Ecomplex-(Ehost+Eguest) (1)

能量最低的分子對(duì)接結(jié)果隨后導(dǎo)入Schrodinger公司Maestro軟件包(2016.04)中,隨后使用Desmond分子動(dòng)力學(xué)軟件[17]對(duì)其進(jìn)行化學(xué)動(dòng)力學(xué)模擬,進(jìn)而評(píng)價(jià)分子對(duì)接結(jié)果的穩(wěn)定性。

操作順序如下:首先將能量最低(即得分最高)的分子對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入Maestro中,經(jīng)過(guò)加氫和化學(xué)鍵鍵級(jí)糾錯(cuò)后,再將其置于一個(gè)棱長(zhǎng)為10 ?的立方體箱子中心,這個(gè)箱子中填充滿(mǎn)TIP3P模式水分子。由于CPT與CD分子均為電中性并且前述研究中所涉及的水溶液中并無(wú)緩沖鹽存在,因此這個(gè)體系中無(wú)需添加任何離子。使用Desmond默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行體系弛豫過(guò)程和體系能量的最小化。分子動(dòng)力學(xué)模擬采用NPT系綜,溫度采用Nose-Hoover耦合方法并設(shè)定為300 K,弛豫時(shí)間為1 ps,壓力采用Martyna-Tobias-Klein方法控制為1.013 25 bar,弛豫時(shí)間為2 ps,采用各向同性壓強(qiáng)耦合,模擬積分步長(zhǎng)設(shè)置為5 fs。體系經(jīng)過(guò)2 ns平衡后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,時(shí)長(zhǎng)為30 ns。

2 結(jié)果與討論

2.1 相溶解度法分析

圖2給出了通過(guò)監(jiān)測(cè)CPT的λmax處(369.5 nm)吸光度所得到的6種CD存在時(shí)CPT的相溶解度曲線。由圖可見(jiàn),在CD濃度為1×10-4～1×10-3mol/L范圍內(nèi),CPT溶解度S與CD濃度c之間存在良好的線性關(guān)系,線性方程及相關(guān)系數(shù)R2見(jiàn)表1。由圖2中曲線可以看出,當(dāng)濃度為1.0×10-3mol/L時(shí),DM-β-CD具有最大的增溶作用,而γ-CD的增溶作用幾乎不隨濃度變化,本文推測(cè)這可能是γ-CD空腔較大,結(jié)合客體能力不強(qiáng)導(dǎo)致。

表1 不同CD/CPT復(fù)合物的平衡常數(shù)Table 1 The stability constants of CD/CPT inclusion complexes

圖2 多種CD存在時(shí)CPT的相溶解度曲線Fig.2 Phase solubility curves of CPT in aqueous solution with the existence of various CDs

根據(jù)Higuchi和Connors[18]的分類(lèi),圖2中CPT與各種CD的相溶解度曲線均為AL型,表明CPT和CD之間均形成1∶1型復(fù)合物,根據(jù)公式K=斜率/(S0×(1-斜率))可計(jì)算出復(fù)合物的結(jié)合常數(shù),其中S0為CPT在水中溶解度,斜率是各條擬合直線斜率。經(jīng)實(shí)驗(yàn)獲得CPT在水中溶解度S0為1.000 53×10-5mol·L-1,由此計(jì)算得到6種CD/CPT復(fù)合物的平衡常數(shù)K見(jiàn)表1,可以看出DM-β-CD的K值最大,具有最大的增溶作用。

圖3 DM-β -CD/CPT復(fù)合物(A)、DM-β -CD/CPT物理混合物(B)、DM-β -CD(C)與CPT(D)的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of DM-β -CD/CPT inclusion complex(A), DM-β -CD/CPT physical mixture(B), DM-β -CD(C) andCPT(D), respectively

2.2 紅外光譜分析

圖3為DM-β-CD/CPT復(fù)合物、DM-β-CD/CPT物理混合物、DM-β-CD與CPT紅外光譜圖。通過(guò)比對(duì)可以看出,1 741 cm-1處羰基吸收峰在物理混合物與復(fù)合物譜圖中均存在,但是在復(fù)合物譜圖中強(qiáng)度明顯下降,顯示復(fù)合物中此羰基與DM-β-CD存在相互作用;CPT的1 581 cm-1處吸收峰則在復(fù)合物譜圖中完全消失,說(shuō)明CPT的芳香環(huán)骨架振動(dòng)受到嚴(yán)重限制,推測(cè)是復(fù)合物中CPT復(fù)合在DM-β-CD空腔中所致。

2.3 分子模擬計(jì)算結(jié)果

本文采用分子對(duì)接推測(cè)DM-β-CD/CPT復(fù)合物的結(jié)構(gòu),300次分子對(duì)接后所得的能量最低對(duì)接結(jié)果示于圖4。從圖可知CPT分子沿著大口深入DM-β-CD空腔中,芳香環(huán)部分幾乎完全被包結(jié)在DM-β-CD疏水性空腔內(nèi),羥基、羰基等官能團(tuán)位于DM-β-CD大口邊緣處,并且分別與DM-β-CD之間形成距離分別為2.3、2.6與3.0 ?的3個(gè)氫鍵。

為了考查分子對(duì)接結(jié)果的可靠性, 本文還通過(guò)半經(jīng)驗(yàn)計(jì)算探究了復(fù)合物形成前后主客體分子能量變化情況, 所得結(jié)果列于表2。 表2所示的ΔEcomplexation值均小于0可知復(fù)合物能量小于主客體能量之和, 即CPT與DM-β-CD復(fù)合在熱力學(xué)上是自發(fā)的。無(wú)論采用PM6-D3H4還是PM7方法計(jì)算, 都可獲得相近的結(jié)果,說(shuō)明DM-β-CD/CPT復(fù)合物具有很好的熱力學(xué)穩(wěn)定性, 驗(yàn)證了分子對(duì)接結(jié)果的可靠性。

表2 DM-β -CD、CPT與DM-β -CD/CPT的半經(jīng)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果Table 2 Semiempirical calculation results of DM-β -CD, CPT and DM-β -CD/CPT

本文還通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬考查了分子對(duì)接結(jié)果的可靠性和復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。圖5為30 ns時(shí)間內(nèi)DM-β-CD/CPT復(fù)合物中主、客體相對(duì)初始位置RMSD隨時(shí)間的變化情況。由圖可見(jiàn)在分子動(dòng)力學(xué)模擬開(kāi)始后,體系迅速達(dá)到平衡,主、客體中原子位置的變化均在非常小的范圍內(nèi)。在30 ns時(shí)間內(nèi),DM-β-CD與CPT的平均RMSD分別為1.772 1與0.423 8 ?,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)均比較小,分別為0.271 3與0.051 93 ?,表明主客體在30 ns時(shí)間內(nèi)主客體均未發(fā)生較大的位置改變與形變,說(shuō)明復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)。

圖4 DM-β -CD與CPT最優(yōu)分子對(duì)接結(jié)果

圖5 DM-β -CD/CPT復(fù)合物中DM-β -CD和CPT相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的RMSD隨時(shí)間變化圖

3 結(jié) 論

本文采用相溶解度法研究了α-CD、β-CD、γ-CD、DM-β-CD、2HP-β-CD、6Glu-β-CD等6種CD對(duì)CPT的增溶,結(jié)果表明這些增溶劑均可以與CPT形成1∶1型復(fù)合物并具有一定的增溶能力,其中DM-β-CD具有最強(qiáng)的增溶作用。

本文還通過(guò)FT-IR法驗(yàn)證了DM-β-CD/CPT復(fù)合物的存在與結(jié)構(gòu)特點(diǎn),并采用分子對(duì)接技術(shù)推測(cè)了復(fù)合物的可能結(jié)構(gòu),結(jié)果表明CPT通過(guò)進(jìn)入DM-β-CD空腔并且與端口處氧原子之間形成氫鍵方式形成復(fù)合物。半經(jīng)驗(yàn)量子化學(xué)計(jì)算與分子動(dòng)力學(xué)模擬表明DM-β-CD/CPT復(fù)合物具有很強(qiáng)的熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。

天然環(huán)糊精具有安全無(wú)毒、包結(jié)能力強(qiáng)的特點(diǎn),作為藥物輔料廣泛應(yīng)用于各種藥物制劑研究中?；瘜W(xué)修飾可提高環(huán)糊精的水溶性并影響其空腔大小與性質(zhì),雖然DM-β-CD的空腔體積略小于β-CD,但是具有更好的包結(jié)能力,與藥物形成的復(fù)合物也具有更好的穩(wěn)定性與水溶性。復(fù)合物中主客體之間存在明顯的疏水作用與氫鍵并具有良好的穩(wěn)定性。本文研究結(jié)果表明,DM-β-CD是一種CPT的良好增溶劑,由于其毒性低[19]、增溶效果明顯、所形成的復(fù)合物穩(wěn)定性強(qiáng),在難溶性藥物制劑開(kāi)發(fā)與臨床應(yīng)用方面具有很好的潛力。