洪瑩瑩, 王雅倩, 周小莉, 詹玉林*

(1.上海海洋大學 水產科系國家級實驗教學示范中心/海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心/農業(yè)部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306; 2.上海健康醫(yī)學院 附屬第六人民醫(yī)院東院 骨科,上海 201306)

慢性骨髓炎多由金黃色葡萄球菌感染造成,會導致骨破壞和骨痂形成.外傷后人工骨的移植也會導致該病發(fā)生發(fā)病率高達1.5%至2.5%[1],這是骨科臨床面臨的難題之一.現(xiàn)有的材料如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠鏈等需要手術取出[2],病人不僅會承受再次手術的痛苦還增加了二次感染的概率.可降解水凝膠材料具有良好的生物相容性,在藥物控釋方面具有廣闊的應用前景,是近幾十年來廣泛研究的一種可植入藥物傳遞基質.材料在室溫下是一種可注射流體，它可以在體溫條件下形成不易流動，并具有一定支撐能力的膠體.因此它可以在注射后，在組織的局部原位形成水凝膠達到移植的目的，相比于創(chuàng)口較大的手術移植方式更為簡單安全[3-4].殼聚糖(chitosan,CS)作為一種天然多糖,具有抗菌、抗炎、易降解等優(yōu)勢,可以制備緩釋微球[5-6]，還可以制備可載藥的智能溫度響應水凝膠[7].石墨烯是一種二維的碳同素異形體,具有多種優(yōu)勢,如促進成骨活性、具有較大的藥物傳遞表面積和抗菌活性[8].氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯經強酸氧化所制得的單層碳納米材料,具有良好的導電性能、導熱性能和機械性能[9],在體內可經水降解途徑代謝[10].尤其是它優(yōu)良的導電性，氧化石墨烯可以避免手術后瘢痕的形成[11].可用于腫瘤治療,骨組織工程和負載藥物等方面[4,12].CS與GO二者結合所形成的水凝膠材料CS/GO可以注入慢性骨髓炎患處,這類可降解性的材料可以避免二次手術取出[13].同時凝膠材料可以負載緩釋粒子,攜帶針對性緩釋抗生素,避免全身大劑量應用抗生素如萬古霉素(vancomycin,VAN)所造成的耳毒性和腎毒性[14].含有可降解高聚物的緩釋微球可以延長緩釋時間[15],石墨烯的高模量可以增加凝膠穩(wěn)定性[16]和抗壓性能[17].本實驗旨在研究一種可以包載藥物且抗壓強度相對較高的可注射凝膠材料,一定程度的延長載藥微球的緩釋時間，并通過一些體外測試探討其作為潛在的骨組織工程材料的可能性.

1 材料與方法

1.1 材料

CS(脫乙酰度90%),購于上海生工生物.GO(單層),購于上海源葉生物.VAN(純度>99%),購于上海邁瑞化學.聚乳酸羥基乙酸共聚物(polyclactic-co-glycolic acid, PLGA,相對分子量10 000)購于上海源葉生物.聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA，低粘度，相對分子量16 000),購于上海多烯生物.

1.2 含VAN的CS/PLGA微球的制備

微球用乳化超聲法制作[15,18],進行一定的調整改進,稱取100 mg的鹽酸萬古霉素溶于1 mL去離子水中,作為水相.稱取200 mg PLGA溶于1 mL二氯甲烷中,作為油相.將水相與油相混合后,超聲4 min形成初乳,將初乳滴加入10 mL質量分數(shù)2%的PVA溶液中,混勻.將復乳迅速滴加到100 mL體積比為2∶3的質量分數(shù)3%PVA水溶液和質量分數(shù)1%CS乙酸溶液的混合溶液中,1 500 r/min下磁力攪拌4 h，可見微球沉淀.將含有微球的混合液置于離心機中10 000 r/min離心10 min,去離子水洗滌3次.得到載藥微球,凍干備用.

1.3 微球載藥量和包封率測定

稱取10 mg的VAN-CS/PLGA載藥微球,加入1 mL乙酸,溶解微球中的CS,離心后上清液吸出備用,沉淀用1 mL乙腈溶解,離心后上清液吸出與乙酸上清混勻作為樣品.標準品溶于乙酸和乙腈體積比為1∶1混合溶液中,配制濃度梯度紫外測定后描繪標準曲線.根據(jù) 2010 年版 《中華人民共和國國家藥典》 規(guī)定,載藥量和包封率的計算公式為:

載藥量=微粒中所含的藥質量/微粒的總質量×100%

包封率=微粒中包封的藥質量/微粒中包封與未包封的總藥質量×100%

1.4 含載藥微球的CS/GO溫敏水凝膠的制作

取質量分數(shù)為2%的CS鹽酸溶液5 mL,400 r/min磁力攪拌下逐滴加入含有質量分數(shù)5% GO的500 μL β-甘油磷酸鈉(β-GP),用飽和的磷酸氫二鈉水溶液調至生理pH值.加入20 mg凍干后的載藥微球, 混合液超聲30 s混勻后,置于37 ℃水浴鍋中形成凝膠.

1.5 載藥微球和復合支架形貌觀察

將VAN-CS/PLGA載藥微球分散到導電膠上,噴金后采用掃描電鏡(Hitachi JSM-7500F,Japan)觀察微球的表面形貌.

微球的粒徑采用激光粒度儀(英國Zetasizer Nano ZS)測定Malvern.

復合支架:放入-80 ℃ 的冰箱冷凍過夜,凍干后用手術刀片將其切割為0.5 cm×0.5 cm的薄片,噴金后利用掃描電鏡觀察支架截面形貌.

1.6 支架孔隙率測定

采用無水乙醇置換法測定其孔隙率[19].將材料凍干后切成小塊,浸入裝有無水乙醇的量筒中,其中無水乙醇的體積為V1.抽真空5 min,將材料孔隙內空氣抽空,使乙醇進入材料孔隙內,至無氣泡溢出為止,此時總體積計為V2.將材料取出后剩余無水乙醇的體積為V3,3個平行樣品a，b，c,測定其平均值計算孔隙率結果.

材料孔隙率ε=(V1-V3)/(V2-V3)×100%.

1.7 凝膠成膠時間及支架機械強度測定

成膠時間:采用試管倒置法觀察其成膠,當材料表現(xiàn)出由“自由流動的溶膠”轉變?yōu)椤澳z狀態(tài)”.將凝膠液注入10 mL試管,置于37 ℃水浴鍋中,觀察其成膠情況,當試管倒置30 s凝膠液仍不出現(xiàn)倒流,則視為凝膠形成[20].

機械強度:凝膠放入模具中,置于37 ℃下形成直徑為9 mm,高為0.5 cm的凝膠圓柱體,將圓柱體置于天平上,上方懸一可施力物體,天平另一端用塑料小杯配平后凝膠端開始施力,小杯端加水,始終保持天平為平衡狀態(tài),直至凝膠完全破碎.m為加入水的質量，g=9.8 N/kg，S為凝膠的表面積.測量3次記錄平均值.

支架的機械強度計算公式為:Rc=mg/S

1.8 凝膠的可逆性[21]

將2 mL溶膠態(tài)的材料打入10 mL試管中,置于37 ℃直至形成凝膠,再將溫度降至4 ℃.觀察該凝膠是否會再變回流動的溶膠態(tài),若有變化,則該凝膠是可逆的,反之則為不可逆的.

1.9 支架降解測定及體外釋放實驗

降解:取20支50 mL試管,加入已成型的載藥凝膠,加入20 mL PBS緩沖液(含0.2 mg/mL溶菌酶),置于臺式恒溫搖床中37 ℃,120 r/min下持續(xù)震蕩,于放入前及第7、14、21、28、35、42、48天取出仍存在的凝膠,用濾紙吸干表面水分稱質量,繪制降解曲線.

釋放:另取20支50 mL試管,加入該凝膠,上述條件下,于第24 h及第7、14、21、28、35、42、48天取1 mL PBS,離心后利用紫外分光光度計測定其上清液藥物質量濃度.考慮到試管內容物濃度的穩(wěn)定性,所吸出液體的沉淀物與上清液在測試完畢后混勻滅菌,打回試管內.記錄藥物釋放速率,繪制曲線.

2 結果

2.1 微球載藥量和包封率

VAN的原始投入量為100 mg.微球中所含藥物的平均質量為12.204 mg,PLGA/CS-VAN載藥微球的載藥率為(1.20±0.007)%,包封率為(12.20±0.668)%,VAN的最低抑菌質量濃度為2 mg/L,所制備的微球具有適宜的載藥性能.VAN的標準曲線見圖1,4個樣品的質量與吸光度見表1.

圖1 微球中VAN質量濃度的標準曲線

Fig.1 Standard curve of vancomycin for detect the drug load of microspheres

得出該標準曲線的擬合方程為：y=0.026+0.003 2x，R2=0.997 5

表1 各樣品的吸光度及由此計算出的藥物質量

Table 1 The absorbance of each sample and the drug content

微球樣品名稱D(280 nm)m/g樣品①0.4280.099 6樣品②0.4000.106 3樣品③0.3850.100 8樣品④0.4280.102 2

2.2 載藥微球和復合支架形貌觀察

VAN-PLGA/CS載藥微球形態(tài)呈規(guī)則的球形,表面光滑(圖2a).微球粒徑分布均勻,在 5～18 μm之間,平均粒徑約為7.07 μm(圖3).由三維的網狀結構VAN-CS/PLGA-CS/GO的復合支架斷面粗糙多孔、孔徑主要分布在10 μm上下、孔多類似圓形、大部分孔間相互連通、孔隙率較高(圖2b).將支架截面的掃描電鏡圖放大后,可觀察到一些顆粒狀粗糙凸起(圖2c),這些顆粒包裹在支架之中,有可能為微球或單層氧化石墨烯的顆粒狀存在,在復合支架掃描電鏡的視野范圍內沒有觀察到獨立的“載藥微球”結構,推測是微球被支架包裹或是支架的孔隙形成“牢籠”結構鎖住微球.

a:VAN-CS/PLGA微球;b,c: VAN-CS/PLGA-CS/GO支架a: VAN-CS/PLGA microspheres; b,c: VAN-CS/PLGA-CS/GO scaffolds

2.3 支架孔隙率、凝膠成膠時間、支架機械強度及可逆性

孔隙率:將支架切割為3 mm×4 mm×5 mm的小條塊,投入1.2 mL量筒內,注入1 mL無水乙醇.公式計算得其孔隙率為(66.94±1.24)%.機械強度及成膠效果：空白CS凝膠<加入載藥微球組<加入GO與載藥微球組(表2).推測產生這樣結果的原因是:加入載藥微球組的凝膠粘度增加,微球表面可以分散一部分所受外力.而加入GO與載藥微球組的成膠時間大幅縮短,抗壓強度提高近一倍,原因可能是由于GO的高模量片層狀結構在凝膠中與載藥微球共同提供了應力支撐.且3組凝膠皆未出現(xiàn)在4 ℃條件下轉變回溶膠態(tài)的現(xiàn)象,成膠效果穩(wěn)定.

圖3 VAN-PLGA/CS 微球的粒徑分布

表2 加入材料對凝膠成膠時間與機械強度的影響

Table 2 The relationship between different adding materials with gluing time and mechanical strength

處理方法凝膠時間/s抗壓強度/kPa空白CS凝膠1653.304±0.032加入載藥微球1573.660±0.055加入GO與載藥微球1306.398±0.295

2.4 支架降解測定及體外釋放實驗

隨著降解時間延長,凝膠材料的質量逐漸減小.根據(jù)凝膠的降解情況(圖4),稱量其濕質量所繪制的降解曲線(圖5)表示,凝膠在約第41天完全降解.但根據(jù)其藥物釋放曲線(圖6)卻發(fā)現(xiàn),凝膠完全降解的1周后(第48天),VAN仍在釋放,原因可能有兩種,一方面,凝膠降解后形成絮狀沉淀物和凝膠小塊,這些凝膠小塊仍在降解過程中；另一方面,凝膠降解后釋放出載藥微球,而載藥微球對藥物的釋放仍是有一定周期的.所以在第48天,測得VAN的藥物回收率約為68.6%.

圖4 凝膠的降解情況

圖5 凝膠的降解曲線

圖6 藥物的釋放曲線

3 討論

慢性骨髓炎的治療是現(xiàn)今臨床上的一個巨大挑戰(zhàn),因許多病例會出現(xiàn)肉芽組織或瘢痕.石墨烯作為碳納米材料應用于骨組織工程材料還有一個獨特的優(yōu)勢,如人骨髓間充質干細胞可識別獨立的碳納米管并沿著碳納米管的排列方向生長,細胞形態(tài)呈現(xiàn)出取向性的紡錘形態(tài),而且其成骨分化作用得到增強[22].這樣可以使細胞有序生長,減少患處瘢痕的形成.在可降解的載藥溫敏凝膠中加入石墨烯材料,可以實現(xiàn)局部抗炎、抗菌、促成骨、預防瘢痕等多種治療效果.

材料成膠時間約為130 s,在注入患處后,體溫條件下成膠迅速,根據(jù)殼聚糖溫敏水凝膠材料的特性,可以考慮應用時采用燈光輻照加溫等措施,在保持細胞活性的前提下,適當提升溫度,可以使凝膠成膠的速度進一步縮短:在120 r/min的轉速下,其降解時間為41 d,在凝膠全部降解后,剩余的微球材料仍可以緩慢釋放藥物.凝膠孔隙均勻,表面粗糙,適宜細胞粘附及長入.根據(jù)此類制備方法,可以考慮遞送促成骨因子等其他治療藥物,實現(xiàn)更廣泛的應用.材料的降解時間比預期稍短,推測其原因為轉速設置較大,設置此轉速的主要原因是凝膠材料在體內比在體外降解的速度更快些[23].后續(xù)可以進一步研究凝膠材料的細胞毒性,體內降解時間以及最佳載藥量等特性,以期獲得更加適于在骨組織工程中應用的材料.

綜上所述,本實驗中所制備的溫敏水凝膠材料,成功實現(xiàn)了對載藥微球的包裹,其制備過程簡單,因加入了氧化石墨烯,其抗壓強度相對于單純的殼聚糖水凝膠材料有大幅提升，成膠相對迅速,孔隙度良好,為后續(xù)進一步探索提供了依據(jù).