吳晨，魏昀，葛珊，高慧琴

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由SARS-CoV-2病毒引發(fā)的傳染病[1]。自2019年12月以來，病毒已在全球多個國家和地區(qū)蔓延[2-3]，感染患者的常見癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、咳嗽和呼吸急促等[4]。盡管在大多數(shù)情況下，患者僅表現(xiàn)出輕微癥狀[5]，但也不乏出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、出凝血功能障礙和多器官衰竭等重癥的患者[3,6]。目前，全球病例死亡率約為1%～5%，并隨病例的年齡和健康狀況表現(xiàn)出差異。目前，世界衛(wèi)生組織(WHO)已宣布COVID-19全球性大流行[2]并將其上升為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科理論為基礎(chǔ)，配合分子對接技術(shù)從生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)角度系統(tǒng)綜合地闡釋藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示多分子藥物協(xié)同作用于機(jī)體的關(guān)鍵[8]，這與中醫(yī)藥整體系統(tǒng)的治療思想不謀而合[9]。

夏天無(Coydalisdecumbens(Thunb.)Pers.)為罌粟科植物伏生紫堇的干燥塊莖。味苦、微辛，性溫，具有活血活絡(luò)、行氣止痛、祛風(fēng)除濕之功效[10]。夏天無所含成分多樣[11]，研究表明，夏天無具有抗炎、抗心律失常、改善視力、提高記憶力和鎮(zhèn)痛等作用[12-13]。通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺v2.0(TCMIP v2.0)[14]檢索COVID-19基因集合對應(yīng)的高頻中藥時，發(fā)現(xiàn)夏天無出現(xiàn)在高頻中藥的首位。因此，本研究將借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討夏天無對于COVID-19的影響機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫

本研究所使用在線數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)址(見表1)，使用的分析軟件為：Cytoscape3.2.1，AutoDock Mgltools1.5.6，AutoDock Vina 1.1.2[15]和pyMOL2.2.0。

1.2 構(gòu)建COVID-19疾病靶點數(shù)據(jù)庫

以“Corona Virus Disease 2019”為關(guān)鍵詞于TCMIP和 GeneCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行疾病靶點檢索(截止2020年3月10日)，收集整理與 COVID-19 發(fā)病相關(guān)的靶點，下文簡稱“疾病靶點”，構(gòu)建COVID-19疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

表1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究數(shù)據(jù)庫

1.3 篩選夏天無的活性成分并預(yù)測作用靶點

以“夏天無”為關(guān)鍵詞于 TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索其中藥成分，根據(jù)數(shù)據(jù)庫建議參考標(biāo)準(zhǔn)：生物口服利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[16]，匯總得到夏天無的活性成分，下文簡稱“活性成分”。將匯總后的活性成分通過 PubChem 轉(zhuǎn)換為Canonical SMILES標(biāo)準(zhǔn)格式，并導(dǎo)入 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測夏天無活性成分的作用靶點。

1.4 構(gòu)建“活性成分-重要靶點”網(wǎng)絡(luò)

將夏天無活性成分作用靶點和COVID-19的疾病靶點通過Uniport數(shù)據(jù)庫整合為統(tǒng)一的Uniprot ID并借助VENNY2.1進(jìn)行映射，篩選夏天無活性成分可直接作用的疾病靶點，下文簡稱為“重要靶點”。

將活性成分和重要靶點的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，繪制“中藥-活性成分-重要靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。本研究借助“節(jié)點自由度(Dgree)≥平均節(jié)點自由度(AverageDgree)”這一標(biāo)準(zhǔn)篩選夏天無治療COVID-19的核心靶點和重要成分。

1.5 構(gòu)建重要靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將重要靶點導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫，在數(shù)據(jù)庫內(nèi)設(shè)置蛋白質(zhì)種類為“Homo sapiens(人類)”、作用閾值設(shè)置為“medium confidence(中等)”、其他條件保持默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，輔助篩選核心靶點，匯總核心靶點，將作用于核心靶點數(shù)量前3名的重要成分定為核心成分。

1.6 篩選KEGG信號通路并富集GO生物過程

將夏天無作用于COVID-19的核心靶點導(dǎo)入 DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫Functional Annotation模塊，設(shè)置導(dǎo)入基因格式為“OFFICAL_GENE_SYMBOL”并分析夏天無治療COVID-19主要涉及的KEGG信號通路。借助Cytoscape3.2.1的ClueGo分析模塊，選用Use Go Term Fusion功能，設(shè)置P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，分析夏天無核心靶點參與的生物過程。

1.7 核心成分和SARS-CoV-2病毒蛋白靶點的對接

通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫以“COVID-19”為關(guān)鍵詞檢索并下載Match score較高的SARS-CoV-2病毒蛋白結(jié)構(gòu)COVID-19 main protease with unliganded active site(PDB ID:6y84)，以下簡稱為COVID-19(6y84),保存為.pdb格式。以目前臨床使用的抗新型冠狀肺炎藥物利托那韋為參照[17]，借助ZINC數(shù)據(jù)庫Substances模塊檢索夏天無核心成分和利托那韋的化學(xué)結(jié)構(gòu)并保存為.mol2格式。通過pyMOL2.2.0去除病毒蛋白結(jié)構(gòu)中的水分子和其他配體小分子后導(dǎo)入Mgltools1.5.6處理，通過加氫，計算電荷，合并非極性氫后保存成.pdbqt格式。同樣方法處理夏天無核心成分和利托那韋的結(jié)構(gòu)后保存為.pdbqt格式。設(shè)置Grid Box 大小為40×40×40個網(wǎng)格點，每個網(wǎng)格點距離0.375 nm，使用CMD命令字符運行AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行核心成分和利托那韋小分子與病毒蛋白的對接，取打分最高的構(gòu)象導(dǎo)入pyMOL2.2.0進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 COVID-19疾病靶點數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建結(jié)果

通過查詢TCMIP和GeneCards數(shù)據(jù)庫，將數(shù)據(jù)整合后共得到723個與 COVID-19相關(guān)的疾病靶點(截至2020年3月10日)，并將這723個疾病靶點構(gòu)建為COVID-19 疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

2.2 中藥活性成分的篩選及作用靶點的預(yù)測結(jié)果

以關(guān)鍵詞“夏天無”檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，共檢索到夏天無含有18個成分。根據(jù)方法1.3中數(shù)據(jù)庫建議參考標(biāo)準(zhǔn)篩得夏天無含有的8個活性成分，(見表2)。將以上8個活性成分通過 PubChem 轉(zhuǎn)換為Canonical SMILES標(biāo)準(zhǔn)格式(見表3)，導(dǎo)入 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這8個活性成分可作用于853個(400種)靶點。

表2 夏天無活性成分及相關(guān)參數(shù)

表3 夏天無活性成分Canonical SMILES標(biāo)準(zhǔn)格式表

2.3 “活性成分-重要靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

將夏天無的活性成分作用靶點與疾病靶點映射得到75個中藥活性成分可直接作用的疾病靶點，即為重要靶點(見圖1)。通過Cytoscape 3.2.1軟件繪制“中藥-活性成分-重要靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D(見圖2)，分析結(jié)果中AverageDgree=5.882，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)8個活性成分 Degree≥5.882，均入選重要成分，其中罌粟次堿和荷包牡丹堿并列Degree最大值=27；而重要靶點中Degree≥5.882的即為核心靶點，共5個：HTR1A, SLC6A4, CYP2D6, PIK3CA和CHRNA4，提示這5個靶點在COVID-19病程中起到關(guān)鍵作用。

注：兩圓相交部分為重要靶點。圖1 作用靶點和疾病靶點靶點映射圖

注：箭頭形為中藥節(jié)點夏天無，三角形節(jié)點為活性成分，圓形節(jié)點為重要靶點，方形節(jié)點為疾病；由綠色到黃色再到紅色，自由度逐漸升高。圖2 夏天無對“中藥-活性成分-重要靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D

2.4 核心靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

將重要靶點導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，該網(wǎng)絡(luò)共涉及到37個節(jié)點，106條線段，其中24條線段相互作用。借助Cytoscape3.2.1分析發(fā)現(xiàn)(見圖4)，AverageDgree=8.438，其中Dgree≥8.438的核心靶點共有34個，其中以 TGFBR2和TGFB1的作用關(guān)系最為緊密。與結(jié)果2.3中核心靶點整合后，共得到核心靶點35個(見表4)。

圖3 夏天無重要靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 重要靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表4 夏天無作用于COVID-19的核心靶點

2.5 KEGG信號通路的富集結(jié)果

通過DAVID數(shù)據(jù)庫KEGG信號通路版塊富集，共富集到與核心靶點相關(guān)的KEGG通路17條，其中P<0.05的信號通路共有11條，P<0.01的信號通路共有4條(圖5)。通過分析P<0.01的重要信號通路可知，核心靶點主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路(ptr04080:Neuroactive ligand-receptor interaction)、膽堿能突觸抗炎信號通路(ptr04725:Cholinergic synapse)、催乳素信號通路(ptr04917:Prolactin signaling pathway)和鈣離子信號通路(ptr04020:Calcium signaling pathway)。其中，最優(yōu)通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路。

圖5 核心靶點 KEGG通路富集結(jié)果

2.6 GO生物過程的富集結(jié)果

將夏天無的35個核心靶點基因進(jìn)行GO分析生物過程富集，共富集到53條生物過程(P<0.01)(見圖6,7)，并可分為5大類(見圖8)，分別為：生物堿應(yīng)激反應(yīng)過程(response to alkaloid)、對尼古丁的行為反應(yīng)過程(behavioral response to nicotine)、血管調(diào)節(jié)過程(regulation of blood vessel diameter)、認(rèn)知過程(learning)和低密度脂蛋白粒應(yīng)激反應(yīng)過程(response to low-density lipoprotein particle)。其中，核心靶點在生物堿應(yīng)激反應(yīng)生物過程中影響最大，約占55%。

圖6 核心靶點GO生物過程分析結(jié)果1

圖7 核心靶點GO生物過程分析結(jié)果2

2.7 核心成分和SARS-CoV-2病毒蛋白靶點的對接

因夏天無的8個活性成分都入選了重要成分，故根據(jù)其能作用于核心靶點數(shù)目的多少排序，紫罌粟次堿、PDSP1_000624、荷包牡丹堿和球紫堇堿分別作用于核心靶點19個、18個和16個，排名重要成分前3名的成分，簡稱核心成分。以目前臨床常用的利托那韋為參照，采用 Autodock vina 1.1.2 進(jìn)行分子對接，對接的參數(shù)設(shè)置及相應(yīng)的計算結(jié)果見表5。當(dāng)結(jié)合能小于-5.0 表示有較好結(jié)合活性，結(jié)合能分值小于-7.0 則表示具有強(qiáng)結(jié)合[18]，活性對接結(jié)果顯示，利托那韋的結(jié)合能為-8.8 kcal/moL，紫罌粟次堿的結(jié)合能為-9.6 kcal/moL，PDSP1_000624的結(jié)合能為-9.3 kcal/moL，荷包牡丹堿的結(jié)合能為-10.1 kcal/moL，球紫堇堿的結(jié)合能為-9.3 kcal/mol。夏天無核心成分的結(jié)合能均小于-7.0，說明核心成分可與COVID-19(6y84)形成能量低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、結(jié)合活性較高的構(gòu)象，且結(jié)合效果強(qiáng)于利托那韋，值得進(jìn)一步研究。由圖8可知，利托那韋的五元硫氮環(huán)上的氮原子與COVID-19(6y84)上的THR-199位點蛋白殘基形成氫鍵，距離為3.4；紫罌粟次堿的1,3-二惡茂上的氧原子與COVID-19(6y84)上的ARG-4位點蛋白殘基形成氫鍵，距離為2.3 ；荷包牡丹堿的五元環(huán)酯基上的兩個氧原子分別與COVID-19(6y84)上的LYS-5位點蛋白殘基形成氫鍵，距離分別為2.5和2.7；PDSP1_000624和球紫堇堿的1,3-二惡茂上的氧原子及苯環(huán)上的羥基與COVID-19(6y84)上的LYS-5位點蛋白殘基形成氫鍵，距離分別為2.7和2.2。

圖8 核心靶點GO生物過程分類

表5 夏天無核心成分及利托那韋與COVID-19(6y84)的結(jié)合情況

圖9 COVID-19(6y84)與利托那韋、紫罌粟次堿、PDSP1_000624、荷包牡丹堿和球紫堇堿分子對接示意圖

3 討論

截止到目前，我國的防疫工作已取得階段性的勝利，但距離全面戰(zhàn)勝COVID-19仍有很長的征程。一方面，雖然在我國本輪疫情流行高峰已經(jīng)過去，但是全球其他國家仍處在疫情大爆發(fā)階段，輸入性病例仍需謹(jǐn)慎；另一方面，世界范圍內(nèi)仍然缺少針對COVID-19高效低毒的疫苗或藥物。在長達(dá)2個多月的抗疫斗爭中，因為我黨的堅強(qiáng)引導(dǎo)和人民共同團(tuán)結(jié)，堅持中西醫(yī)并重，使得中醫(yī)藥在抗疫舞臺上大展身手。以甘肅省為例，截至3月2日，甘肅省91例確診患者中，共有89例接受了中醫(yī)藥治療，中醫(yī)藥參與治療率達(dá)到了97.8%，中醫(yī)藥參與治療率居全國前列[19]。

通過中醫(yī)辨證，已將COVID-19劃為中醫(yī)學(xué)“疫病”或“瘟疫”范疇，不同于狹義的傷寒和溫病或時病(風(fēng)溫、濕溫、冬溫)，因患者分布地域廣泛，個體差異較大，也產(chǎn)生了不同的看法。仝小林等[20]根據(jù)發(fā)病季節(jié)在冬季將本病歸屬于“寒濕(瘟)疫”的范疇，病性上屬陰病，是感受寒濕疫毒而發(fā)病。劉清泉等[21]認(rèn)為，武漢市的氣候條件加之暖冬季節(jié)和年末寒濕天氣，形成了濕邪疫癘之氣致病的外在條件，屬于中醫(yī)“疫病”“濕瘟”的范疇，其病因?qū)傩詾椤皾穸局啊敝虏?。范逸品等[22]結(jié)合多方特點認(rèn)為，本次新冠肺炎更符合寒疫特征，且“燥”邪居于主要地位。

在目前臨床治療中，夏天無并非治療COVID-19的臨床用藥，但從藥性角度來講，其味苦、微辛，性溫，對COVID-19的寒濕疾病屬性具有糾偏的作用，符合中醫(yī)“寒者熱之”的用藥理論；另外夏天無具有活血活絡(luò)，祛風(fēng)除濕之功效，與COVID-19患者的重度炎癥表現(xiàn)相互吻合。另一方面，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段對夏天無和COVID-19的已知靶點進(jìn)行分析研究，從成分角度為夏天無的可能具備的療效提供了證據(jù)。通過研究發(fā)現(xiàn)，夏天無的核心成分共4個，分別是紫罌粟次堿、PDSP1_000624、荷包牡丹堿和球紫堇堿，其中Degree最大的成分為紫罌粟次堿和荷包牡丹堿。紫罌粟次堿屬于芐基異喹啉類生物堿，有興奮子宮的作用；荷包牡丹堿屬于異喹啉類生物堿，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗癌及腸道平滑肌解痙作用[23]，并且已有報道稱荷包牡丹堿對人GLC細(xì)胞、人子宮癌HeLa細(xì)胞以及KB細(xì)胞都有一定的抑制作用[24]。夏天無可作用于BDKRB2, HTR1A, PPARG和CCR1等35個核心靶點，其中，BDKRB2和HTR1A等對血管擴(kuò)張具有一定促進(jìn)作用[25-26]，而PPARG和CCR1等則與炎癥的發(fā)生密不可分[27-28]。這些核心靶點主要作用位點涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、膽堿能突觸抗炎信號通路、催乳素信號通路以及鈣離子信號通路。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這些靶點所在通路影響的機(jī)體反應(yīng)與多數(shù)COVID-19患者在臨床表現(xiàn)出的血液C反應(yīng)蛋白(CRP)升高和血沉升高，部分重癥患者的肌鈣蛋白升高及炎癥因子升高和少數(shù)死亡病例出現(xiàn)的血管內(nèi)皮脫落和血栓形成相關(guān)[17]。與此同時，夏天無成分作用的核心靶點還與生物堿應(yīng)激反應(yīng)過程、對尼古丁的行為反應(yīng)過程、血管調(diào)節(jié)過程、認(rèn)知過程和低密度脂蛋白粒應(yīng)激反應(yīng)過程5類生物過程相關(guān)。通過分子對接發(fā)現(xiàn)，夏天無核心成分與COVID-19(6y84)病毒蛋白的結(jié)合能均小于-7.0，說明核心成分與COVID-19(6y84)能夠形成能量低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、結(jié)合活性較高的構(gòu)象，1,3-二惡茂上的氧原子是夏天無核心成分發(fā)揮藥效的關(guān)鍵結(jié)合位點，COVID-19(6y84)上的LYS-5蛋白殘基具有極佳的結(jié)合效果，為其治療相關(guān)疾病提供了物質(zhì)成分的構(gòu)象基礎(chǔ)，也為其發(fā)揮藥效提供了可能，為進(jìn)一步展開藥理學(xué)實驗提供了參考。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)挖掘了夏天無治療COVID-19的重要成分，預(yù)測了重要成分的作用靶點，構(gòu)建了“中藥-活性成分-重要靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，分析了核心靶點互作關(guān)系，篩選了 KEGG 通路和生物過程，并利用分子對接技術(shù)將夏天無和COVID-19(6y84)病毒蛋白進(jìn)行對接，深入探討了夏天無的作用機(jī)制，提示夏天無具備治療COVID-19的成分物質(zhì)基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步研究。但是，由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也面臨著數(shù)據(jù)庫查詢靶點的準(zhǔn)確性存在爭議性；被查詢靶點不能確定其激活或抑制作用；中藥成分被檢索時，只能定性不能定量等問題，而本研究僅通過數(shù)據(jù)庫的檢索分析來討論夏天無的核心成分及作用機(jī)制，其結(jié)果仍需進(jìn)一步實驗驗證。