馬彥江，陳天朝，魯靜，于蘭蘭，王嬌，姚超，牛曉靜*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南省直第三人民醫(yī)院，河南 鄭州 450006；3.駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店463000；4.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉[1]，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味酸、澀，微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補益肝腎、收澀固脫的功效，臨床常用于眩暈耳鳴，腰膝酸痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫，內(nèi)熱消渴等證，現(xiàn)代藥理研究其具有抗心律失常、降血糖、保肝、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等作用[2-4]。

九蒸九曬指采用蒸法和曬法反復(fù)炮制中藥材，具體細節(jié)因藥材品種不同而不同，主要目的是糾偏藥材藥性或增加藥效成分。傳統(tǒng)的九蒸九曬品種主要有何首烏、地黃、黃精、黑芝麻等[5]，九蒸九曬后均具增強補益的作用。鑒于酒炙后的山茱萸也增強了補益肝腎作用[6]，國家級非物質(zhì)文化傳人朱清山依據(jù)自己多年經(jīng)驗開發(fā)出九蒸九曬山茱萸，但炮制技藝局限于個人經(jīng)驗，缺乏客觀可控的參數(shù)?；谥兴幘哂卸喑煞帧⒍喟悬c的作用特點，因此本實驗以水浸出物、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、多糖的含量為指標(biāo)，運用均勻設(shè)計法，考察黃酒用量、燜潤時間、蒸制時間和蒸制次數(shù)等工藝參數(shù)，以期得到九蒸九曬山茱萸最佳炮制工藝。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Thermo Evolution 201紫外分光光度計(賽默飛世爾科技有限公司)；UltiMate 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Hk250型科導(dǎo)臺式超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)；LXJ-IIB型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；FW-500型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 材料

5-HMF(批號：A22J7L166074，質(zhì)量分數(shù)≥98%),馬錢苷(批號：R23D7F27552，質(zhì)量分數(shù)≥98%)，D(+)﹣無水葡萄糖對照品(批號：S08J6G1，質(zhì)量分數(shù)≥98%)(上海源葉生物科技有限公司)；莫諾苷(批號：17051604，質(zhì)量分數(shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水；黃酒(浙江古越龍山紹興酒股份有限公司)；其他試劑均為分析純。

山茱萸(批號:1702091，安徽普仁中藥飲片有限公司)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉。

2 方法與結(jié)果

2.1 水浸出物測定

山茱萸水浸出物含量按照《中國藥典》2015年版四部通則2201項下水溶性浸出物測定法的冷浸法測定。

2.2 5-HMF、莫諾苷、馬錢苷的測定

2.2.1 色譜條件

采用Agilent 公司Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，7%A；20～50 min，7～20%A)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為240 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。5-HMF、莫諾苷和馬錢苷混合對照品及山茱萸九制品的HPLC色譜圖見圖1。結(jié)果表明，樣品中的其他成分不干擾5-HMF、莫諾苷和馬錢苷的測定。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取5-HMF、莫諾苷和馬錢苷的對照品適量，用80%甲醇配成濃度分別為1.505、0.510和0.505 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱定均勻試驗樣品(1～8號)約0.2 g，置錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱重，回流1 h，放涼，再稱重，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即可。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取對照品儲備液1、2、4、6、8、10 mL，置于6個50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，配制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進樣測定，以對照品的濃度(C)為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液(6號樣品)10 μL，連續(xù)進樣6次，測得5-HMF、莫諾苷和馬錢苷峰面積的RSD分別為0.8%，0.6%和0.5%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(6號樣品)，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果5-HMF、莫諾苷和馬錢苷峰面積的RSD分別為1.1%，1.4%和1.2%，表明供試品溶液中3種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗

取同一供試品溶液(6號樣品)，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得到樣品中5-HMF、莫諾苷和馬錢苷含量的平均值分別為2.12%，0.66%和0.76%，RSD分別為1.3%，1.0%和1.1%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密稱取山茱萸樣品(6號樣品)1 g，共6份，分別加入對照品儲備液1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，5-HMF、莫諾苷和馬錢苷的平均回收率分別為98.1%，97.3%和98.9%，RSD分別為3.15%，2.23%和2.86%，結(jié)果表明，該方法的回收率較好。

圖1 5-HMF、莫諾苷和馬錢苷混合對照、山茱萸九制HPLC色譜圖

2.2.9 樣品含量測定

取均勻試驗樣品(1～8號)，按“2.2.3”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品中5-HMF、莫諾苷和馬錢苷的含量。

2.3 多糖的含量測定

2.3.1 0.1%蒽酮硫酸溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蒽酮0.1 g，加入80%的硫酸溶液100 mL，使溶解，即得，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻，制成每1 mL含0.107 mg的葡萄糖溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密稱定均勻試驗樣品(1～8號)約2 g，加8倍量95%乙醇，回流8 h脫脂，藥渣揮干，用20倍量蒸餾水在80 ℃回流提取2.5 h，趁熱過濾，提取2次，合并濾液，定容至100 mL，取水煎液10 mL，加入4倍量無水乙醇，4 ℃放置過夜，離心，棄去上清液，沉淀用水溶解，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL具塞刻度試管，加水至2 mL，搖勻，迅速精密加入0.1%蒽酮硫酸溶液6 mL，混勻后于沸水浴中加熱15 min，取出，立即置于冰水浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，在625 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=11.279C+0.020 6(R2=0.999 1)，結(jié)果顯示吸光度與無水葡萄糖在0.010 7～0.064 2 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗

精確吸取同一供試品溶液(6號樣品)2 mL，按照上述蒽酮硫酸法顯色，并測定吸光度，重復(fù)平行實驗6次，記錄吸光度，得到RSD為0.37%，結(jié)果表明，該儀器的精密度好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

精確吸取同一供試品溶液(6號樣品)2 mL，按上述蒽酮硫酸法顯色，并測定吸光度，每隔10 min測定1次，60 min內(nèi)RSD為0.69%，結(jié)果表明，該供試品溶液在60 min內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.3.7 加樣回收率試驗

精密稱取山茱萸樣品(6號樣品)1 g，共6份，分別精密加入葡萄糖對照品溶液(17.39 mg/mL)1 mL，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按上述蒽酮硫酸法顯色并測定吸光度，多糖的平均回收率為97.3%，RSD為4.23%，結(jié)果顯示，證明該方法的回收率較好。

2.3.8 樣品含量測定

精密量取供試品溶液2 mL，置于10 mL具塞刻度試管，搖勻，迅速精密加入新配制的0.1%蒽酮硫酸溶液6 mL，混勻后于沸水浴中加熱15 min，取出，立即置于冰水浴中冷卻15 min，取出，在625 nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品溶液中多糖含量。

2.4 均勻試驗設(shè)計

表2 因素水平表

表3 均勻設(shè)計試驗及結(jié)果

利用SPSS 22.0對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸分析處理，得到回歸方程為：Y=49.961+18.314X3+6.249X4-3.131X3X4，R=0.954，P=0.015<0.05，表明回歸方程擬合度高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。X3與X4存在交互作用。X3X4的系數(shù)為負值，說明各指標(biāo)成分提取率呈負相關(guān)；X3，X4的系數(shù)為正值，說明其與各指標(biāo)成分提取率呈正相關(guān)。

根據(jù)回歸方程，可得山茱萸最佳九蒸九曬工藝為黃酒用量15%、燜潤時間1.5 h、蒸制時間1.5 h、蒸制次數(shù)9次。

3 工藝驗證

取山茱萸100 g，共3份，按照“2.5”項下所得到的最佳工藝條件進行驗證試驗，對山茱萸九制品中有效成分的含量進行測定，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、可行。

表4 工藝驗證結(jié)果

4 討論

九蒸九曬作為中藥特色炮制技術(shù)，具有悠久的歷史和深厚的文化底蘊。始見于唐朝孟詵的《食療本草》，其中記載了九蒸九曬黃精的炮制方法及功效。經(jīng)后世歷代醫(yī)藥學(xué)家發(fā)揚光大，九蒸九曬的中藥品種逐步增加，炮制工藝和輔料選擇進一步細化。早在清朝時期，河南省禹州趙隆太藥行的九蒸九曬地黃就在柏林的“萬國博覽會”上獲得金獎，被稱為“隆熟地”，但后因多種原因九蒸九制九蒸九曬工藝失傳。2006年，國家級非物質(zhì)文化傳人、老藥工朱清山先生依據(jù)自己多年經(jīng)驗成復(fù)制出“黑如漆、光如油、甘如飴”的古法九蒸九曬熟地，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出九蒸九曬槐角、山茱萸等品種。但受歷史條件、認知能力及科學(xué)水平的限制，目前可參照的九蒸九制炮制工藝仍以來經(jīng)驗判別，且工藝繁瑣、效率低下，缺乏客觀可控的參數(shù)，質(zhì)量控制點僅憑外觀性狀、口感等傳統(tǒng)經(jīng)驗，缺乏數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化的炮制工藝標(biāo)準(zhǔn)。隨著“健康中國”戰(zhàn)略的實施和民眾對養(yǎng)生的重視，古法炮制中藥迎來了發(fā)展的春天，傳統(tǒng)經(jīng)驗炮制工藝技術(shù)已不能滿足市場需求和食藥監(jiān)管的要求。因此，建立數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化的九蒸九曬炮制工藝，對中醫(yī)藥文化的傳播、中藥炮制技術(shù)的傳承、古法炮制中藥飲片的品牌樹立具有重要意義。

山茱萸富含酯類、五環(huán)三萜類、鞣質(zhì)和多糖等活性成分。研究發(fā)現(xiàn)莫諾苷具有神經(jīng)保護作用[7-9]，馬錢苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗休克、抗過氧化等作用[10]，2015年版《中國藥典》也把環(huán)烯醚萜苷類化合物莫諾苷和馬錢苷作為山茱萸的定量指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖具有提高免疫、抗炎、抗衰老和抗氧化、提高骨髓造血及抗腫瘤細胞的作用[11]，是其補益肝腎的主要物質(zhì)基礎(chǔ)；5-HMF是中藥炮制加熱過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物，是炮制程度的指標(biāo)性成分，也是山茱萸炮制后補益肝腎作用增強的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[11-15]?；谥兴幘哂小罢w性、多靶點、協(xié)同性”的特點，故本試驗選擇水浸出物、莫諾苷、馬錢苷、5-HMF和多糖的含量作為綜合評價指標(biāo)進行炮制工藝研究。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)黃酒用量、蒸制時間、蒸制次數(shù)3個因素間存在交互作用，與傳統(tǒng)炮制經(jīng)驗相符。經(jīng)過試驗，最終優(yōu)選出九蒸九曬山茱萸的最佳工藝為黃酒用量15%、燜潤時間1.5 h、蒸制時間1.5 h、蒸制次數(shù)9次。驗證實驗證實該方法穩(wěn)定、可行，將為九蒸九曬山茱萸炮制工藝研究和炮制品質(zhì)量評價提供了數(shù)據(jù)支撐。