鄭登勇 朱淑瑜 吳強

[摘要] 目的 探討鱉甲煎丸對腹膜透析（PD）小鼠腹膜纖維化的抑制作用及可能機制。 方法 采用ICR小鼠4.25%腹透液2.0 mL每日腹腔注射一次，并于第3、5、7天聯(lián)合脂多糖0.8 mg/kg腹腔注射造模;鱉甲煎丸1.2 g/kg每日灌胃一次，干預6周后，測腹透超濾量，HE染色和Masson染色觀察壁層腹膜形態(tài)改變及腹膜厚度;Western blot檢測臟層腹膜組織N-cadherin、ZO-1的蛋白表達水平，及pAkt、總Akt的蛋白表達水平。 結(jié)果 腹膜透析（PD）組、鱉甲煎丸（BJJW）組與對照（Control）組比較，超濾量均顯著下降（P<0.05）;壁層腹膜均顯著增厚（P<0.01）。臟層腹膜ZO-1蛋白表達降低，N-cadherin蛋白表達升高，pAkt也明顯升高（均P<0.01）。BJJW組與PD組比較，超濾量明顯改善（P<0.05），壁層腹膜厚度降低（P<0.01）;臟層腹膜ZO-1蛋白表達增加，N-cadherin蛋白表達下降，pAkt也明顯下降（均P<0.01）。 結(jié)論 鱉甲煎丸抑制腹膜纖維化，PI3K/Akt信號調(diào)節(jié)腹膜間皮細胞上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（EMT）是其機制之一。

[關(guān)鍵詞] 鱉甲煎丸;腹膜透析;腹膜纖維化;上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化;PI3K/Akt信號

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）09-0032-04

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of Biejiajian pill on peritoneal fibrosis in peritoneal dialysis（PD） mice and its possible mechanism. Methods ICR mice were injected intraperitoneally with 4.25% peritoneal dialysis solution 2.0 mL once a day， combined with lipopolysaccharide 0.8 mg/kg on the 3rd， 5th and 7th day to build model. Biejiajian pill 1.2 g/kg were administrated daily by gavage. After 6 weeks of intervention， the volume of peritoneal ultrafiltration was measured， HE staining and Masson staining were used to observe the changes in peritoneal morphology and peritoneal thickness of the parietal peritoneum. Western blot was used to detect the expression levels of N-cadherin and ZO-1， pAkt and total Akt in visceral peritoneal tissue. Results Compared with that of the control group， the volume of peritoneal ultrafiltration in the peritoneal dialysis（PD） group and Biejiajian pill（BJJW） group was significantly lower（P<0.05）， and the parietal peritoneum in PD group and BJJW group was significantly thickened（P<0.01）. Visceral peritoneal ZO-1 protein expression was reduced， N-cadherin protein expression was increased， and pAkt was also significantly increased（P<0.01）. Compared with that of the PD group， the volume of peritoneal ultrafiltration in BJJW group was significantly improved， and the peritoneal thickness of the parietal peritoneum decreased（P<0.05）. The visceral peritoneal ZO-1 protein expression increased， N-cadherin protein expression decreased， and pAkt also significantly decreased（all P<0.01）. Conclusion Biejiajian pill inhibits peritoneal fibrosis， and the regulation of epithelial to mesenchymal transition（EMT） of peritoneal mesothelial cells from PI3K/Akt signal is one of its mechanisms.

[Key words] Biejiajian pill; Peritoneal dialysis; Peritoneal fibrosis; Epithelial to mesenchymal transition; PI3K/Akt signal

腹膜透析（Peritoneal dialysis，PD）因為腹膜纖維化而導致超濾失敗，已成為患者退出腹膜透析的主要原因之一[1]。腹膜間皮細胞上皮-間皮細胞轉(zhuǎn)分化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腹膜透析發(fā)生腹膜纖維化的基礎[2，3]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路，可調(diào)節(jié)PD腹膜間皮細胞EMT的發(fā)生，導致腹膜纖維化的發(fā)生和發(fā)展，PI3K/Akt信號為腹膜纖維化防治的新靶點[4，5]。鱉甲煎丸用于脅下癥塊，具有活血化瘀、軟堅散結(jié)的作用。鱉甲煎丸具有顯著的抗肝、腎、肺纖維化作用[6-9]，但未見治療腹膜纖維化的報道。本研究通過超濾量、壁層腹膜厚度等指標觀察鱉甲煎丸治療腹膜透析小鼠腹膜纖維化的療效;并通過觀察臟層腹膜組織ZO-l、N-cadherin及pAkt等蛋白表達水平，從PI3K/Akt信號調(diào)節(jié)EMT的角度探討鱉甲煎丸干預腹膜纖維化的機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性ICR小鼠24只，鼠齡6～8周，體重25～30 g，購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號[SCXX（閩）2016-0002]。于12 h光照、恒溫（22±2）℃、40%～60%相對濕度條件下標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。動物實驗過程遵守福建中醫(yī)藥大學關(guān)于動物實驗倫理學的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑

鱉甲煎丸（50 g/瓶，國藥準字Z42020772，國藥集團中聯(lián)藥業(yè)有限公司）;4.25%腹膜透析液（廣州百特醫(yī)療用品有限公司）;脂多糖：sigma，貨號L2880;抗phospho-Akt1Ser473抗體9018S、抗Akt1抗體2398S（美國CST）;抗ZO-1（ab216680）、N-cadherin（ab18203）、GAPDH抗體（ab181602）（Abcam公司）;HRP標記的兔二抗（Abcam公司）;BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（碧云天）。

1.3 模型制作與給藥方法

24只ICR小鼠均分三組（n=8）：（1）對照（Control）組，左下腹腹腔注射（Intraperitoneal injection，ip）生理鹽水2.0 mL，每日一次。（2）腹膜透析（PD）組，4.25%腹透液2.0 mL左下腹ip，每日一次，并于第3、5、7天聯(lián)合ip脂多糖（Lipopolysaccharide，Lps）0.8 mg/kg造模，即脂多糖加生理鹽水配成0.08 mg/mL，按0.1 mL/10 g每日ip一次;對照組予匹配同量生理鹽水。（3）鱉甲煎丸（BJJW）組，造模同腹膜透析組，給予鱉甲煎丸（1.2 g/kg）加純凈水配成0.12 g/mL溶液，按0.1 mL/10 g每日灌胃一次。其余兩組予純凈水0.1 mL/10 g每日灌胃一次。干預6周。

1.4 試驗取材

第42天透析1 h末，用4%水合氯醛麻醉小鼠。在腹部中線部位作切口，用無菌紗布仔細吸附收集腹透液，并準確計量紗布增重，計算各組小鼠超濾量。留取各組小鼠右側(cè)壁層腹膜，用10%中性緩沖液福爾馬林固定24 h后石蠟包埋，4 μm切片行蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin stain，HE）染色及馬松（Masson）染色。留取臟層腹膜立即置于液氮中保存，后續(xù)轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)Western blot檢測。

1.5 觀察指標

（1）觀察各組小鼠一般情況，每日測量體重并準確記錄。（2）準確測量記錄各組小鼠的腹膜透析超濾量。（3）HE染色：觀察小鼠壁層腹膜間皮下基質(zhì)，炎癥細胞、成纖維細胞浸潤。（4）Masson染色：觀察壁層腹膜纖維化情況，并測量腹膜間皮下基質(zhì)厚度，每個標本隨機選取10個高倍鏡視野，取平均值作為厚度。（5）Western blot檢測臟層腹膜組織間皮細胞EMT指標N-cadherin、ZO-1的蛋白表達水平，及pAkt、總Akt的蛋白表達水平。磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑cocktail各10 μL加入1 mL的RIPA裂解液;取約50 mg -80℃凍存的臟層腹膜組織，加入蛋白裂解液后冰上超聲充分粉碎，低溫離心后取上清液，BCA法測組織的蛋白濃度，采用10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入抗小鼠的Akt1（1∶1000）、p-Akt1（1∶1000）、ZO-1（1∶1000）、N-cadherin（1∶1000）、GAPDH（1∶2000）抗體，4℃過夜，1：5000稀釋的HRP標記的相應二抗室溫孵，化學發(fā)光成像儀曝光顯像，采用ImageJ圖像處理軟件對條帶灰度進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad prism 8.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)中的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠實驗期間體重變化比較

各組小鼠實驗期間左下腹腹腔注射不斷更換注射部位，無明顯硬結(jié)，腹膜透析耐受性良好，無小鼠死亡。實驗開始時體重無差異（P>0.05），腹膜透析組和鱉甲煎丸組注射Lps期間稍萎靡，體重增長偏慢，此后體重逐漸增長，到實驗結(jié)束時兩組體重雖較對照組略減輕，但無顯著性差異（P>0.05）。BJJW組體重雖略重于PD組，也無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見表1。

2.2 三組小鼠腹膜透析超濾量及壁層腹膜厚度變化比較

PD組、BJJW組腹膜透析超濾量與Control組比較，超濾量均顯著下降（P<0.05）;BJJW組與PD組比較，其超濾量明顯改善（P<0.05）。見表2。

2.3 三組小鼠腹膜組織形態(tài)學改變比較

HE染色，對照組小鼠壁層腹膜間皮下基質(zhì)薄，少見有炎癥細胞浸潤;PD組可見腹膜基質(zhì)增多、有核細胞浸潤增多;而BJJW組上述改變明顯減輕。MASSON染色，PD組、BJJW組與Control組比較，腹膜組織顯著增厚（P<0.01）。BJJW組與PD組比較，腹膜厚度相應改善（P<0.01）。見表2、封三圖1。

2.4 三組小鼠臟層腹膜N-cadherin、ZO-1、Gapdh蛋白表達水平比較

ZO-1/Gapdh灰度比值（Control組：0.45±0.02;PD組：0.16±0.01;BJJW組：0.33±0.02）;N-cadherin/Gapdh灰度比值（Control組：0.14±0.01;PD組：0.53±0.02;BJJW組：0.35±0.01）;PD組、BJJW組與Control組比較，上皮細胞標志物ZO-1蛋白表達降低，間充質(zhì)細胞標志物N-cadherin蛋白表達升高（均P<0.01）。BJJW組與PD組比較，ZO-1蛋白表達增加，N-cadherin蛋白表達下降（均P<0.01）。見圖1。

2.5 三組小鼠臟層腹膜pAkt、Akt蛋白表達水平比較

pAkt/總Akt灰度比值（Control組：0.15±0.01;PD組：0.43±0.01;BJJW組：0.26±0.02）;PD組、BJJW組與Control組比較，Akt磷酸化水平（pAkt）也明顯升高（均P<0.01）。BJJW組與PD組比較，pAkt明顯降低（均P<0.01）。見圖2。

3 討論

腹膜透析因為腹膜纖維化而導致超濾失敗已成為患者退出腹膜透析的主要原因之一[1]。在長期的腹膜透析過程中高糖及反復發(fā)生的腹膜炎是導致腹膜纖維化的主要原因[2]。腹透液高糖、高滲等因素可致腹膜間皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，引起腹膜纖維化[10，11]。腹膜透析相關(guān)性腹膜炎其炎癥相關(guān)因子作用于腹膜間皮細胞亦可導致腹膜纖維化[2，12]。故本研究采用4.25%腹透液聯(lián)合第3、5、7天脂多糖0.8 mg/kg腹腔注射造模，貼近臨床;PD組腹膜透析超濾量與對照組比較，超濾量顯著下降（P<0.05）;壁層腹膜病理形態(tài)可見腹膜基質(zhì)層膠原增多，炎癥細胞浸潤;腹膜組織顯著增厚（P<0.01），提示小鼠建立腹膜纖維化模型成功。

研究表明腹膜間皮細胞EMT是腹膜纖維化的早期、可逆性環(huán)節(jié)，是促進腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[3，13]。腹膜間皮細胞EMT表現(xiàn)為上皮細胞標志物如ZO-1、E-cadherin等表達降低，而間充質(zhì)標志物如N-Cadherin、Vimentin、α-SMA表達升高。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是細胞質(zhì)內(nèi)的脂類激酶，具有蛋白激酶活性，PI3K的主要下游是絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt。PI3K/Akt信號調(diào)節(jié)細胞增殖與分化，在纖維化中發(fā)揮重要作用[5，14]。已有研究證實PI3K/Akt信號通路參與調(diào)節(jié)PD腹膜間皮細胞EMT的發(fā)生，促進腹膜纖維化[4，5]。本課題亦發(fā)現(xiàn)PD組與Control組比較，臟層腹膜組織ZO-1蛋白表達降低，N-cadherin蛋白表達升高，pAkt也明顯升高（均P<0.01），證實PI3K/Akt信號為腹膜纖維化的防治靶點。

近年臨床及實驗研究證實，中醫(yī)藥防治腹膜纖維化取得明顯的效果，并發(fā)現(xiàn)單味中藥及復方中藥可通過多靶點防治PD腹膜間皮細胞EMT進展[15];單藥如黃芪、丹參、川芎、三七、大黃等（包括其有效成分），復方如腎康注射液、參芎注射液、扶腎顆粒等，介導EMT的信號通路眾多，目前研究主要涉及TGF-β/Smad信號通路和Notch信號通路[13]。鱉甲煎丸出自《金匱要略·瘧病脈證并治第四》，用于脅下癥塊，具有活血化瘀、軟堅散結(jié)的作用。鱉甲煎丸多用于抗肝纖維化。腹膜纖維化中醫(yī)亦屬于“微型癥積”、“血瘀證”范疇[15]。鱉甲煎丸干預腹膜纖維化切合中醫(yī)病機。

本研究以鱉甲煎丸干預腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化小鼠6周，BJJW組與PD組比較，其超濾量明顯改善（P<0.05），壁層腹膜厚度也相應減輕（P<0.01）;臟層腹膜組織ZO-1蛋白表達增加，N-cadherin蛋白表達下降，Akt磷酸化水平（pAkt）也明顯降低（均P<0.01），提示鱉甲煎丸可改善腹膜超濾功能，抑制腹膜纖維化，PI3K/Akt信號調(diào)節(jié)腹膜間皮細胞上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化是其機制之一。本研究擴大了古方的實驗研究范圍，為下一步繼續(xù)篩選鱉甲煎丸的中藥組分干預腹膜纖維化打下基礎。

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（收稿日期：2020-03-06）