張倩 韓婕 湯旭磊

蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000

破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，其形成、分化和功能異常會(huì)造成骨吸收異常，骨代謝不平衡，骨吸收超過(guò)骨形成會(huì)造成骨質(zhì)疏松等多種骨疾病[1-2]。天然的中草藥提取物白藜蘆醇是一類具有抗炎、抗氧化、抗衰老等多種生物學(xué)活性的多酚類化合物，研究顯示白藜蘆醇對(duì)缺乏運(yùn)動(dòng)[3]、衰老[4]、卵巢切除[5-6]等多種因素引起的骨量丟失都具有骨保護(hù)作用。近年來(lái)白藜蘆醇對(duì)破骨細(xì)胞的研究主要集中在炎癥等條件下引起的骨量流失的現(xiàn)象和機(jī)制方面。在非炎癥條件下，白藜蘆醇對(duì)破骨細(xì)胞影響及機(jī)制的研究較少。有研究表明自噬參與破骨細(xì)胞形成、分化及骨吸收作用等多個(gè)階段[7-9]，而白藜蘆醇能夠調(diào)節(jié)自噬，在不同的細(xì)胞中可以誘導(dǎo)自噬，也可以抑制自噬[10-11]。因此本實(shí)驗(yàn)主要研究不同濃度白藜蘆醇對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響及自噬在其中的作用，探討白藜蘆醇影響破骨細(xì)胞分化可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC；高糖DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone)；胎牛血清、雙抗溶液(四季青)；核因子κВ受體活化因子配體RANKL(美國(guó)PeproTech)；TRAP染色試劑盒、白藜蘆醇(美國(guó)Sigma)；3-MA(美國(guó)Selleck Chemicals)；RT-PCR 試劑盒、DNA Marker(TaKaRa 生物技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組：小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清，1%雙抗溶液的高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于5 %CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中。細(xì)胞分組Ⅰ：不處理組、RANKL+不同濃度RSV(0、0.1、0.5、1、5及10 μmol/L)組；細(xì)胞分組Ⅱ：RANKL+不同濃度RSV(0、0.5、10 μmol/L)組、3-MA+ RANKL+不同濃度RSV(0、0.5、10 μmol/L)組。RANKL誘導(dǎo)濃度為50 ng/mL。3-MA干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間為10 mmol/L預(yù)刺激1 h，在白藜蘆醇干預(yù)之前加入。

1.2.2細(xì)胞活力檢測(cè)：RAW264.7細(xì)胞按每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁后按細(xì)胞分組Ⅰ處理，分別培養(yǎng)12、24、48、72 h棄上清，加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度。

1.2.3TRAP染色：RAW264.7細(xì)胞按每孔104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板，貼壁后按細(xì)胞分組Ⅰ處理，培養(yǎng)第5天固定液固定細(xì)胞，去離子水清洗后TRAP染色試劑盒進(jìn)行染色。經(jīng)過(guò)初染、洗滌、復(fù)染、洗滌、晾干等程序后顯微鏡觀察形態(tài)并拍照。各組破骨細(xì)胞數(shù)比值通過(guò)Image-Pro Plus軟件對(duì)TRAP染色陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行分析，計(jì)算染色區(qū)域的百分比。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)情況：RAW264.7細(xì)胞按每孔105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，貼壁后按細(xì)胞分組Ⅰ和Ⅱ處理，培養(yǎng)第3天提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增。引物序列如表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primers of target genes

1.2.5Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.4，第3天提取蛋白，定量后加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。上樣后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。放入稀釋好的一抗中Beta Actin(1∶3 000稀釋)，LC3A/B(1∶1 000稀釋)，P62(1∶1 000稀釋)，Becline-1(1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST清洗3次，放入稀釋好的二抗中(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。TBST清洗3次，將ECL發(fā)光液均勻加在膜上，曝光并拍照。采用Image J圖像分析軟件，計(jì)算各條帶的灰度值，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，方差齊性時(shí)，組間多重比較應(yīng)用Fisher Least Significant Difference(LSD)；方差不齊時(shí)，應(yīng)用Dunnett’s T3方法進(jìn)行組間多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活力的影響

如表1和圖1所示：與不處理組相比，加入50 ng/mL誘導(dǎo)劑RANKL均能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖(P<0.05)；同時(shí)加入0.1～10 μmol/L白藜蘆醇時(shí)，細(xì)胞增殖活力先上升后下降，在0.5 μmol/L時(shí)達(dá)到最大。

2.2白藜蘆醇對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

如圖2所示：RAW264.7細(xì)胞在50 ng/mL的RANKL誘導(dǎo)下生成大量TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞。當(dāng)加入0.1 μmol/L和0.5 μmol/L白藜蘆醇時(shí)，TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)量增多；隨白藜蘆醇濃度增加，破骨細(xì)胞數(shù)量減少，白藜蘆醇濃度為10 μmol/L時(shí)抑制RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。

表2 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活力的影響Table 2 The effect of resveratrol on cell

注：與不處理組比較，*P<0.05，與RANKL組比較，#P<0.05。

圖1 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活力影響注：與不處理組比較，*P<0.05，與RANKL組比較，#P<0.05。Fig.1 The effect of resveratrol on cell viability

圖2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響注：與RANKL組相比，*P<0.05。Fig.2 Effects of different concentrations of resveratrol on osteoclast differentiation

2.3不同濃度白藜蘆醇對(duì)破骨及自噬相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示：RAW264.7細(xì)胞加入RANKL后破骨分化相關(guān)標(biāo)志物CTSK、MMP9、TRAP及自噬相關(guān)標(biāo)記物L(fēng)C3、P62、Beclin-1的mRNA表達(dá)增加。加入不同濃度白藜蘆醇干預(yù)，濃度在0.1 μmol/L和0.5 μmol/L時(shí)破骨分化相關(guān)標(biāo)志物及自噬相關(guān)標(biāo)記物mRNA表達(dá)增加；在1、5、10 μmol/L時(shí)隨濃度增加，其mRNA的表達(dá)隨之降低。

圖3 不同濃度白藜蘆醇對(duì)RANKL誘導(dǎo)下破骨及自噬相關(guān)標(biāo)志物mRNA 表達(dá)水平的影響注：與不處理組比較，*P<0.05，與RANKL組比較，#P<0.05。Fig.3 Effects of different concentrations of resveratrol on mRNA expression levels of osteoclast and autophagy related markers induced by RANKL

圖4 不同濃度白藜蘆醇對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響注：與不處理組比較，*P<0.05，與RANKL組比較，#P<0.05。Fig.4 Effects of resveratrol at different concentrations on the expression of autophagy related proteins

圖5 抑制自噬對(duì)破骨及自噬相關(guān)標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響注：*P<0.05。Fig.5 Inhibition of autophagy on mRNA expression levels of osteoclast and autophagy related markers

2.4不同濃度白藜蘆醇對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示：RAW264.7細(xì)胞加入RANKL后自噬相關(guān)蛋白LC3II/I和Beclin-1的表達(dá)增加，P62的表達(dá)減少。LC3II/LC3I增加同時(shí)P62減少說(shuō)明自噬活性增強(qiáng)。加入0.1 μmol/L和0.5 μmol/L白藜蘆醇時(shí)促進(jìn)自噬；隨白藜蘆醇濃度升高則抑制自噬活性。

2.5抑制自噬對(duì)破骨及自噬相關(guān)標(biāo)記物mRNA表達(dá)的影響

加入3-MA，RANKL誘導(dǎo)分化過(guò)程中破骨分化相關(guān)標(biāo)志物CTSK、MMP9、TRAP和自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3、P62、Beclin-1的mRNA表達(dá)減少；0.5 μmol/L白藜蘆醇干預(yù)后CTSK、MMP9、TRAP、 LC3、P62和Beclin-1的mRNA表達(dá)增加，加入3-MA后可抑制其表達(dá)；10 μmol/L白藜蘆醇和3-MA抑制其相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)。

2.6抑制自噬對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示：加入3-MA后，自噬相關(guān)蛋白LC3II/I比值和Beclin-1的表達(dá)下降，蛋白P62的含量增加。3-MA可以完全抑制0.5 μmol/L白藜蘆醇對(duì)自噬的促進(jìn)作用；10 μmol/L白藜蘆醇能抑制自噬，加入3-MA則進(jìn)一步抑制自噬。

3 討論

破骨細(xì)胞來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞系，是由單核前體細(xì)胞融合形成TRAP陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞。RAW264.7細(xì)胞是小鼠源性破骨前體細(xì)胞，RANKL誘導(dǎo)其產(chǎn)生破骨細(xì)胞是一種公認(rèn)的比較成熟的體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法，具有均一性好，獲得破骨細(xì)胞數(shù)多，沒有其他分離、純化等方法產(chǎn)生的如成骨細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，更有利于針對(duì)破骨細(xì)胞研究的開展[12]。

本實(shí)驗(yàn)中顯示0.1、0.5 μmol/L的RSV干預(yù)后TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞增多，而1、5和10 μmol/L RSV的TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞則逐漸減少，RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)了破骨分化相關(guān)標(biāo)志物CTSK、MMP9、TRAP的mRNA表達(dá)水平呈相應(yīng)變化。之前也有研究表明RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中加入1～10 μmol/L的白藜蘆醇，隨白藜蘆醇濃度增加TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)目和組織蛋白酶K的表達(dá)逐漸降低；且其圖示結(jié)果顯示在0.3 μmol/L白藜蘆醇干預(yù)后TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)目有輕微升高[13]。但也有研究顯示M-CSF和RANKL誘導(dǎo)小鼠骨髓提取的前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，加入用虎杖飲片粉提取的白藜蘆醇0.1 μmol/L和1 μmol/L干預(yù)后TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)目減少[14]。與本研究結(jié)果相反，可能是由于白藜蘆醇為其自行提取，藥物純度、分離技術(shù)和用于誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的前體細(xì)胞不同所致。近年來(lái)的研究顯示白藜蘆醇干預(yù)直接抑制破骨細(xì)胞的分化，但干預(yù)濃度多在1～10 μmol/L之間。本研究顯示更低濃度的白藜蘆醇可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，對(duì)白藜蘆醇只抑制破骨細(xì)胞分化有了新的認(rèn)識(shí)。

本研究觀察到0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的白藜蘆醇促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化的同時(shí)，自噬水平逐漸增高；隨白藜蘆醇濃度升高破骨細(xì)胞分化和自噬水平下降。提示白藜蘆醇可能是通過(guò)調(diào)節(jié)自噬影響破骨細(xì)胞的分化。為進(jìn)一步驗(yàn)證白藜蘆醇對(duì)自噬的影響，選取0.5 μmol/L和10 μmol/L白藜蘆醇加入自噬抑制劑3-MA，顯示抑制自噬水平可以抑制0.5 μmol/L白藜蘆醇對(duì)破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用；且抑制自噬可以進(jìn)一步抑制10 μmol/L白藜蘆醇對(duì)破骨細(xì)胞的分化。說(shuō)明白藜蘆醇可能是通過(guò)調(diào)節(jié)自噬影響破骨細(xì)胞的分化。有研究顯示白藜蘆醇能上調(diào)Sirt1的表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)FoxO1蛋白表達(dá)抑制破骨細(xì)胞的分化[15]。也有研究顯示RSV降低TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)并抑制細(xì)胞內(nèi)ROS生成，表明RSV對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用是通過(guò)清除ROS介導(dǎo)的[13]。由此可見白藜蘆醇通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt1、ROS和FoxO1等多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成。而研究表明Sirt1、ROS和FoxO等與自噬之間相互作用形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，Sirt1可以通過(guò)對(duì)自噬基因Atg5、Atg7、Atg8等自噬誘導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分的去乙?；苯佑绊懽允桑?xì)胞核定位的Sirt1還可以通過(guò)激活FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族成員來(lái)誘導(dǎo)自噬通路組分的表達(dá)，乙?；腇oxO1可以在細(xì)胞質(zhì)中與Atg7結(jié)合并直接影響自噬。ROS的相對(duì)過(guò)量積累導(dǎo)致氧化應(yīng)激可以促進(jìn)自噬的形成，自噬通過(guò)吞噬和降解氧化物質(zhì)，進(jìn)而降低氧化損傷，自噬也可以通過(guò)伴侶介導(dǎo)的自噬、有絲分裂、P62傳遞等多種途徑調(diào)節(jié)ROS水平[16-17]。因此白藜蘆醇可能通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt1、ROS、FoxO影響自噬從而影響破骨細(xì)胞的分化，其相互作用和分子調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，白藜蘆醇濃度在0.1～10 μmol/L范圍內(nèi)，破骨細(xì)胞分化和自噬水平先升高后降低，抑制自噬可以抑制破骨細(xì)胞的分化。白藜蘆醇影響破骨細(xì)胞分化可能部分是通過(guò)調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮作用，有望為白藜蘆醇治療骨質(zhì)疏松提供新的作用靶點(diǎn)，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。