馬江濤 萬(wàn)雷 黃宏興*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510375

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨骼疾病，其特點(diǎn)是骨量降低，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致骨脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。隨著人口老齡化以及糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，骨質(zhì)疏松癥在很大程度上已成為“隱形殺手”。預(yù)計(jì)到2050年[1]，全世界60歲及以上的老年人數(shù)將達(dá)到20億。到那時(shí)，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也會(huì)迅猛增加，這將成為沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，OP的治療[2]主要包括補(bǔ)充骨健康基本補(bǔ)充劑(鈣劑、維生素D)，骨吸收抑制劑(雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等)，骨形成促進(jìn)劑(甲狀旁腺素類似物)，活性維生素D及其類似物等。但這些西藥普遍存在不良反應(yīng)眾多、價(jià)格高昂等問(wèn)題，這嚴(yán)重限制了西藥在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，迫切需要尋求高效、安全、價(jià)廉的抗骨質(zhì)疏松新藥。

近年來(lái)，多項(xiàng)研究[3]表明中藥影響骨質(zhì)疏松癥的骨代謝，調(diào)節(jié)人體骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子及信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成，抑制骨量丟失，明顯改善患者骨質(zhì)疏松癥狀。其中，補(bǔ)腎助陽(yáng)、活血化瘀類中藥，如淫羊藿、杜仲、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)等，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療效果顯著。骨碎補(bǔ)[4]，為槲蕨的干燥根莖，性溫、味苦，歸肝、腎經(jīng)，具有活血止痛，補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效，能通血脈、續(xù)筋骨、療傷痛，為傷科要藥。本品含柚皮苷、骨碎補(bǔ)雙氫黃酮苷、骨碎補(bǔ)酸等成分，能促進(jìn)對(duì)鈣的吸收，提高血鈣和血磷水平，有利于骨鈣化和骨質(zhì)的形成。除了抗骨質(zhì)疏松的作用外，骨碎補(bǔ)具有不良反應(yīng)少，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。因此，研究骨碎補(bǔ)中有效成分治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制具有重要的理論價(jià)值。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定的信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于多學(xué)科交叉，整合中藥、中藥有效成分、中藥靶標(biāo)、疾病靶標(biāo)、信號(hào)通路等信息，利用靶標(biāo)的一致性進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，得出中藥-疾病靶標(biāo)并進(jìn)行相關(guān)通路分析，這為科學(xué)研究中藥復(fù)方的作用機(jī)制提供了技術(shù)支持，也為中醫(yī)藥研究的現(xiàn)代化指明了方向。因此，本研究基于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)原理及軟件，探索并構(gòu)建單味中藥骨碎補(bǔ)治療OP的作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步研究骨碎補(bǔ)的作用機(jī)制及新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1資料

本研究使用的數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)分析平臺(tái)見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1骨碎補(bǔ)中有效成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

本研究通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，對(duì)骨碎補(bǔ)的所有有效成分進(jìn)行初步篩選，其中篩選條件[5]為口服生物利用度(oral bioavailability, OB)>30%，藥物類藥性(drug likeness，DL)>0.18，見(jiàn)表2。采用TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型和Perl軟件對(duì)相關(guān)有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2骨碎補(bǔ)靶點(diǎn)基因名(gene symbol)的添加

利用Perl軟件和UniProt知識(shí)庫(kù)為篩選出的靶點(diǎn)基因添加基因名，由于某些靶點(diǎn)可能在UniProt知識(shí)庫(kù)中找不到對(duì)應(yīng)的基因名，無(wú)法找到基因名的靶點(diǎn)刪除，故實(shí)際得到的靶點(diǎn)基因名要少。

1.2.3已知OP相關(guān)疾病靶點(diǎn)基因的獲取

利用“osteoporosis”作為關(guān)鍵詞，對(duì)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行已知疾病靶點(diǎn)基因的檢索及篩選，并刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點(diǎn)基因，得到疾病靶點(diǎn)基因。

1.2.4中藥靶點(diǎn)基因和疾病靶點(diǎn)基因的交集

利用R語(yǔ)言軟件將疾病靶點(diǎn)基因與中藥靶點(diǎn)基因取交集，得到中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因的韋恩圖(見(jiàn)圖1)，從中得到中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因。

1.2.5中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將中藥靶點(diǎn)基因和中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因利用Perl軟件進(jìn)行一一映射，然后利用Cytoscape軟件進(jìn)行計(jì)算，得到中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2)。其中節(jié)點(diǎn)的類型有疾病、中藥、中藥靶點(diǎn)基因和中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因。

1.2.6骨碎補(bǔ)治療OP的靶點(diǎn)基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)基因的篩選

利用STRING在線軟件將中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因輸入軟件，篩選條件為種屬選擇人，最小互作分?jǐn)?shù)值為0.7，保存相應(yīng)結(jié)果文件(見(jiàn)圖3)。將所得文件輸入R語(yǔ)言計(jì)算，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心基因的條圖(見(jiàn)圖4)。

1.2.7GO和KEGG功能富集分析

將中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因利用R語(yǔ)言軟件計(jì)算，得到GO功能富集分析(圖5a、5b)和KEGG功能富集分析(圖6a、6b)。以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1骨碎補(bǔ)有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過(guò)對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中骨碎補(bǔ)所有已報(bào)道的有效成分及其相關(guān)靶點(diǎn)篩選，共搜索到有效成分71個(gè)，相關(guān)靶點(diǎn)587個(gè)。根據(jù)OB和DL參數(shù)對(duì)骨碎補(bǔ)的有效成分進(jìn)行篩選，共獲得有效成分18個(gè)，有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)304個(gè)。

表1 本研究使用的數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)分析平臺(tái) Table 1 Databases and related analysis platforms used in this study

表2 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)骨碎補(bǔ)所有成分根據(jù)OB和DL參數(shù)進(jìn)行篩選后的結(jié)果Table 2 The results of screening all ingredients of Rhizoma Drynariae by OB and DL parameters in TCMSP database

2.2中藥靶點(diǎn)基因和疾病靶點(diǎn)基因的交集

利用R語(yǔ)言軟件將疾病靶點(diǎn)基因與中藥靶點(diǎn)基因取交集，得到中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因的韋恩圖，從中得到中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因98個(gè)。其中疾病靶點(diǎn)基因3 530個(gè)，中藥靶點(diǎn)基因148個(gè)。

圖1 中藥靶點(diǎn)基因和疾病靶點(diǎn)基因的交集Fig.1 The intersection of TCM target genes and disease target genes

2.3中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

圖中紅色代表(菱形)骨質(zhì)疏松癥，藍(lán)色(橢圓形)代表中藥骨碎補(bǔ)，綠色(箭頭形)代表骨碎補(bǔ)的有效成分，黃色(三角形)代表中藥-疾病共同靶點(diǎn)基因。中藥骨碎補(bǔ)主要通過(guò)10種有效成分作用于98個(gè)靶點(diǎn)基因，這98個(gè)靶點(diǎn)基因可能影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

圖2 中藥-疾病-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The regulatory network of TCM-Disease-Target

2.4骨碎補(bǔ)治療OP的靶點(diǎn)基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)基因的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)研究，篩選出骨碎補(bǔ)治療OP的核心靶點(diǎn)基因。其中，鄰接節(jié)點(diǎn)較多的4個(gè)靶標(biāo)分別是：白介素-6基因(IL-6)、JUN基因、絲裂原活化蛋白激酶-1基因(MAPK-1)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因(EGF)。

IL-6[6]是骨吸收的重要環(huán)節(jié)，其以自分泌和旁分泌形式作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)自身合成，調(diào)節(jié)bax/bcl-2比值，抑制破骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。原發(fā)性骨質(zhì)疏松時(shí)骨組織中癌基因c-JUN表達(dá)增加，c-JUN表達(dá)增加與骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞凋亡有關(guān)，c-JUN與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥存在聯(lián)系[7]。MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，MAPK-1是MAPK的一個(gè)亞型，許多胞外信號(hào)通過(guò)MAPK信號(hào)通路，參與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生中具有重要作用[8]。體外實(shí)驗(yàn)表明EGF促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收，抑制成骨細(xì)胞骨形成，參與骨質(zhì)疏松[9]。

圖3 骨碎補(bǔ)治療OP的靶點(diǎn)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Target gene protein protein interaction (PPI) network of Rhizoma Drynariae for OP

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心基因的條圖Fig.4 Barplot of PPI core genes注：左列為基因名，如IL-6(interleukin-6，白介素-6)，數(shù)字為相應(yīng)基因鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目，如IL-6鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目為41。

2.5GO功能富集分析

骨碎補(bǔ)治療OP的核心靶點(diǎn)基因的GO功能富集分析結(jié)果見(jiàn)圖5a、5b。骨碎補(bǔ)治療OP的核心靶點(diǎn)基因的GO功能主要涉及血紅素結(jié)合、輔因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、四吡咯結(jié)合、類固醇激素受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞因子活性、氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)錄激活活性、受體配體活性等。

圖5a GO功能富集分析柱狀圖Fig.5a GO functional enrichment analysis barplot

圖5b GO功能富集分析氣泡圖Fig.5b GO functional enrichment analysis dotplot注：柱狀圖圖形左側(cè)字母為GO名稱，下面數(shù)字為基因的數(shù)目，柱狀圖形表示富集在GO上的基因，P代表富集的顯著性，顏色越紅，富集的程度越高，相應(yīng)的P值越小。

氣泡圖圖形左側(cè)字母為GO名稱，下面數(shù)字為基因的比例，圓圈大小表示富集的基因的數(shù)目，顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，相應(yīng)的P值越小。

2.6KEGG通路富集分析

骨碎補(bǔ)治療OP的核心靶點(diǎn)基因的KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖6a、6b，骨碎補(bǔ)治療OP的核心靶點(diǎn)基因的KEGG功能主要涉及：糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路等。富集程度相對(duì)低的信號(hào)通路有：NF-κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等。

圖6a KEGG功能富集分析柱狀圖Fig.6a KEGG functional enrichment analysis barplot

圖6b KEGG功能富集分析氣泡圖注：柱狀圖圖形左側(cè)字母為KEGG名稱，下面數(shù)字為基因的數(shù)目，柱狀圖形表示富集在KEGG上的基因，P代表富集的顯著性，顏色越紅，富集的程度越高，相應(yīng)的P值越小。Fig.6b KEGG functional enrichment analysis dotplot

綜合有關(guān)骨質(zhì)疏松信號(hào)通路的文獻(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等均參與骨質(zhì)疏松的發(fā)病。

氣泡圖圖形左側(cè)字母為KEGG名稱，下面數(shù)字為基因的比例，圓圈大小表示富集的基因的數(shù)目，顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，相應(yīng)的P值越小。

3 討論

基于中醫(yī)藥“整體觀念”和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“系統(tǒng)生物學(xué)”的理論，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)TCMSP分析平臺(tái)等軟件，構(gòu)建“中藥-有效成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，全面分析整合中藥多種有效成分作用于疾病的靶標(biāo)，深入研究中藥-疾病核心靶標(biāo)的作用機(jī)制，為研究中藥的作用機(jī)制及中藥新藥開(kāi)發(fā)提供技術(shù)和理論支持。

本研究表明，骨碎補(bǔ)的主要有效成分可通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)基因、多個(gè)信號(hào)通路影響OP的發(fā)生。骨碎補(bǔ)治療OP的核心靶點(diǎn)基因主要有IL-6基因、JUN基因、MAPK-1基因、EGF基因等，這些基因可通過(guò)介導(dǎo)骨吸收和骨形成來(lái)調(diào)控骨質(zhì)疏松的發(fā)生。骨碎補(bǔ)治療OP的核心靶點(diǎn)基因的KEGG通路眾多，這些通路主要包括糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路等。柳辰玥[10]研究發(fā)現(xiàn)桑葉水提液可能通過(guò)抑制糖尿病性骨質(zhì)疏松癥患者股骨和脛骨中AGEs/RAGE/Nox4/NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激損傷來(lái)防治糖尿病性骨質(zhì)疏松。陳鵬等[11]發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中TNF-α通過(guò)激活NF-κB來(lái)促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。張國(guó)權(quán)等[12]通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-17通過(guò)上調(diào)cathepsin K、MMP9的表達(dá)量，從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞降解骨基質(zhì)的能力。鐘航等[13]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIF-1信號(hào)通路參與了小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)的病理演變過(guò)程，抑制HIF-1信號(hào)通路可改善PMOP的嚴(yán)重程度。李春亮等[14]通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松合并壓縮性骨折患者Th17細(xì)胞功能的增強(qiáng)能夠影響骨代謝過(guò)程中的炎性反應(yīng)及蛋白酶活性。這些富集度高的信號(hào)通路主要通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷、抑制破骨細(xì)胞形成、促進(jìn)成骨細(xì)胞形成等作用發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。骨碎補(bǔ)可能通過(guò)抑制糖尿病并發(fā)癥患者骨骼的AGE-RAGE信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激損傷來(lái)防治糖尿病性骨質(zhì)疏松；可能通過(guò)TNF-α激活NF-κB來(lái)促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成；可能通過(guò)IL-17上調(diào)cathepsin K、MMP9的表達(dá)量，從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞降解骨基質(zhì)的能力；可能通過(guò)抑制HIF-1信號(hào)通路改善PMOP的嚴(yán)重程度。

綜上所述，骨碎補(bǔ)治療OP的作用機(jī)制是通過(guò)骨碎補(bǔ)中多種活性成分調(diào)控OP相關(guān)的靶點(diǎn)基因，靶點(diǎn)基因進(jìn)一步調(diào)控多種信號(hào)通路，最終在多種信號(hào)通路的綜合作用下，機(jī)體表現(xiàn)出相應(yīng)的表型。這為發(fā)現(xiàn)新通路，調(diào)控富集程度高的信號(hào)通路來(lái)治療疾病以及全面認(rèn)識(shí)中藥與疾病的關(guān)系提供了思路。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)開(kāi)啟了探索中藥復(fù)方治療疾病作用機(jī)制的大門(mén)，必將促進(jìn)中藥的現(xiàn)代化研究。