鮑根強(qiáng) 肖春來(lái) 張國(guó)輝 李華 趙曉亮 王泉

哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院手足外科，河北 衡水 053000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量骨密度降低，骨組織微結(jié)構(gòu)退化，骨強(qiáng)度下降，骨組織脆性增加，骨折危險(xiǎn)性增大為特點(diǎn)的全身性骨骼疾病[1]。骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)作為其最嚴(yán)重的并發(fā)癥，OP不僅增加了患者發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)，也使得骨折愈合更加困難[2]。目前，臨床治療骨質(zhì)疏松的藥物主要包括激素調(diào)節(jié)藥物、加速骨形成藥物、促進(jìn)骨礦化藥物等，這些藥物對(duì)治療OP有一定的療效，但也伴隨嚴(yán)重的不良反應(yīng)[3]。而甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素防治OP以其安全、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，在治療上有較大優(yōu)勢(shì)。骨折修復(fù)愈合需要相關(guān)骨生長(zhǎng)因子的參與和調(diào)節(jié)。因此，本研究探討甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折骨生長(zhǎng)因子及骨折愈合的影響，為臨床藥物治療OPF提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與材料

SPF級(jí)健康雌性SD大鼠75只，3月齡，體重(320±30)g，訂購(gòu)于北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(合格證號(hào)SCXK京2017-002)。重組人甲狀旁腺素(1-34)(100 μg/支，批號(hào)：J201708072，美國(guó)Sigma公司)，鮭降鈣素注射液(密蓋息)(50 IU/支，批號(hào)：1609045，瑞士諾華制藥有限公司)，柜式X線照片機(jī)購(gòu)置于美國(guó)美國(guó)Hologic公司，雙能X線骨密度測(cè)定儀購(gòu)于美國(guó)GE公司，ELISA檢測(cè)試劑盒訂購(gòu)于武漢云克隆科技股份有限公司，兔抗鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、胰島素生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體均購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與藥物干預(yù)

實(shí)驗(yàn)按隨機(jī)數(shù)字法分為：假手術(shù)組、去勢(shì)組、甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組，假手術(shù)組僅切除部分脂肪組織，其他3組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。4周后各組均行右側(cè)股骨干閉合性骨折髓內(nèi)固定術(shù)。于術(shù)后第2 d分別給予不同藥物干預(yù)，假手術(shù)組、去勢(shì)組：皮下注射0.9% NaCl 5 mL/kg，1次/d；甲狀旁腺素組：皮下注射PTH(1-34)50 μg/kg，1次/d；降鈣素組：皮下注射降鈣素5～10 IU/kg，1次/d；聯(lián)合用藥組：皮下注射PTH(1-34)50 μg/kg，1次/d，皮下注射降鈣素5～10 IU/kg，1次/d，連續(xù)用藥8周。SD大鼠飼養(yǎng)SPF級(jí)屏障環(huán)境。

1.2.2構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨折模型

參照駱陽(yáng)等[4]構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型與內(nèi)固定方法。各組大鼠均分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，照明、通風(fēng)、溫度、濕度等飼養(yǎng)環(huán)境條件均相同。

1.2.3組織標(biāo)本處理

攝片后10%水合氯醛麻醉，采取急性大失血法處死大鼠，打開(kāi)胸腔，左心室采血3～5 mL，3 000 r/min，離心15 min，收取上層血清0.5～1 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。剝離取出右股骨，依次分離軟組織，拔出髓內(nèi)克氏針，保護(hù)骨痂組織。截取骨折端長(zhǎng)約1～2 cm股骨痂，0.9% NaCl沖洗后于10%甲醛溶液固定，10%硝酸脫鈣6周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5 μm連續(xù)組織切片，切片60 ℃烤箱4 h，取出室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4放射性(X線)檢查

術(shù)后6周各組選取15只SD大鼠進(jìn)行X線攝片，觀察各組大鼠骨折端骨痂生長(zhǎng)和骨折線模糊情況。放射學(xué)評(píng)估采用Warden等[5]的X線評(píng)分方法，依據(jù)骨折斷端表現(xiàn)進(jìn)行骨折愈合評(píng)分。

1.2.5骨痂骨密度(BMD)和礦物含量(BMC)測(cè)定

取出待測(cè)右股骨骨痂，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測(cè)股骨痂，采用小物體掃描模式，以分辨率1.0 mm×1.0 mm，掃描速度60 mm/s，掃描寬度5.0 cm的參數(shù)值，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，檢測(cè)骨痂BMD和BMC值。

1.2.6血清生化指標(biāo)水平測(cè)定

采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.2.7HE染色

參照HE染色法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作[4]，光鏡下觀察染色并采集圖片。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)新生血管數(shù)，取平均值。

1.2.8免疫組織化學(xué)染色法

參照免疫組織化學(xué)染色法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作[6]，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用平均光密度值(MOD)表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1各組骨折愈合及評(píng)分

假手術(shù)組骨折線模糊不清，骨折端有明顯骨痂包繞生長(zhǎng)，連接緊密，骨密度增高，已達(dá)到臨床愈合；去勢(shì)組骨折線依然清晰可見(jiàn)，少量骨痂生長(zhǎng)，未連接，骨折愈合欠佳；甲狀旁腺素和降鈣素組骨折線部分模糊，骨痂部分生長(zhǎng)，部分連接緊密，骨痂塑形改造期；聯(lián)合用藥組骨折線模糊或消失，骨折端有連續(xù)性骨痂包繞貫穿，大量骨性骨痂形成，開(kāi)始重建塑形，骨折處髓腔再通。假手術(shù)組、去勢(shì)組、甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組骨折愈合評(píng)分分別為：4.788±0.225、2.840±0.134、3.927±0.152、3.862±0.160、4.431±0.175。去勢(shì)組較假手術(shù)組骨折愈合評(píng)分顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢(shì)組骨折愈合評(píng)分升高，其中以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 X線觀察骨折愈合情況注：A 假手術(shù)組；B 去勢(shì)組；C 甲狀旁腺素組；D 降鈣素組；E 聯(lián)合用藥組Fig.1 X-ray observation of fracture healing

2.2各組骨痂BMD和BMC

去勢(shì)組較假手術(shù)組股骨BMD和BMC顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢(shì)組股骨BMD和BMC增高，其中尤以聯(lián)合用藥組增高最顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別nBMD/(g/cm2)BMC/(g)假手術(shù)組 150.215±0.0451.143±0.036去勢(shì)組 150.127±0.020?0.564±0.023?甲狀旁腺素組150.172±0.0270.980±0.025降鈣素組 150.166±0.0310.953±0.026聯(lián)合用藥組 150.195±0.046#1.127±0.030#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與去勢(shì)組比較，#P<0.05。

2.3各組血清生化指標(biāo)水平

去勢(shì)組較假手術(shù)組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平均顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢(shì)組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平升高，其中以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各組骨痂組織學(xué)觀察

假手術(shù)組骨痂區(qū)大量骨小梁形成，生長(zhǎng)旺盛，排列致密有序，交錯(cuò)成網(wǎng)狀，成骨細(xì)胞數(shù)量較多，形成致密板層狀骨，周圍見(jiàn)骨髓腔再通。去勢(shì)組骨痂區(qū)骨小梁明顯減少，生長(zhǎng)稀疏，間隙增寬不連續(xù)，排列紊亂，大量間充質(zhì)干細(xì)胞及纖維軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞、新生微小血管少見(jiàn)。甲狀旁腺素組和降鈣素組骨痂區(qū)骨小梁較前增多，排列較規(guī)則，小梁周圍血管生成增多，成熟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞較前增多。聯(lián)合用藥組骨小梁多，生長(zhǎng)旺盛，交錯(cuò)網(wǎng)狀，排列致密有序，較多成熟的骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，局部見(jiàn)編織骨。

2.5各組蛋白表達(dá)

BMP-2主要表達(dá)于成骨細(xì)胞胞漿，VEGF主要表達(dá)于成骨細(xì)胞質(zhì)及少量成熟軟骨細(xì)胞內(nèi)，TGF-β主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞，

表2 各組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平比較Table 2 Comparison of serum BMP-2, VEGF, TGF-β and IGF-1 levels in each group (μg/L,)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與去勢(shì)組比較，#P<0.05。

圖2 HE染色觀察骨痂的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200)注：A 假手術(shù)組；B 去勢(shì)組；C 甲狀旁腺素組；D 降鈣素組；E 聯(lián)合用藥組；a 骨小梁，b 軟骨細(xì)胞Fig.2 Morphological changes of bone callus was observed by HE staining (×200)

IGF-I主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞。去勢(shì)組較假手術(shù)組BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢(shì)組BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1蛋白表達(dá)升高，其中以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組骨痂組織BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1表達(dá)比較Table 3 Comparison of BMP-2, VEGF, TGF-β and IGF-1 expression in osteophytes of each group ()

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與去勢(shì)組比較，#P<0.05。

3 討論

OPF修復(fù)愈合是一個(gè)極其復(fù)雜有序的骨組織再生過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與調(diào)控，骨生長(zhǎng)因子是指具有刺激骨細(xì)胞生長(zhǎng)活性的因子，在骨折愈合過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用，細(xì)胞因子通過(guò)影響骨細(xì)胞的分化、增殖和成熟，刺激骨和軟骨形成，調(diào)節(jié)骨質(zhì)重建，參與骨折愈合的全過(guò)程[7]。

甲狀旁腺激素(PTH)是骨代謝過(guò)程中調(diào)節(jié)鈣磷代謝的重要調(diào)節(jié)因子，PTH(1-34)不僅刺激軟骨細(xì)胞增殖分化以及軟骨和纖維性骨痂形成，而且還能刺激前成骨細(xì)胞增殖、產(chǎn)生堿性磷酸酶及骨基質(zhì)蛋白，促進(jìn)骨形成，使纖維性骨痂轉(zhuǎn)化為骨性骨痂[8]。同時(shí)，它也可以提高骨痂的生物機(jī)械性能，增加軟骨鈣化，加速骨折愈合[9]。降鈣素(calcitonin，CT)是調(diào)節(jié)骨代謝的重要激素，CT能抑制破骨細(xì)胞的活性和減少破骨細(xì)胞的數(shù)量，從而抑制骨組織的自溶和吸收，減少骨骼中鈣和骨基質(zhì)的流失，抑制骨轉(zhuǎn)化，防止骨量丟失，提高骨密度[10]。此外研究表明CT不僅能作用于成骨細(xì)胞，刺激成骨細(xì)胞增殖和分化，而且還可阻止成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)骨小梁的改建，促進(jìn)骨折愈合[11]。本研究表明去勢(shì)組較假手術(shù)組骨折愈合評(píng)分、股骨BMD和BMC均顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢(shì)組骨折愈合評(píng)分、股骨BMD和BMC均升高，以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。去勢(shì)組骨痂骨小梁明顯減少，生長(zhǎng)稀疏，排列紊亂，成骨細(xì)胞、新生微小血管少見(jiàn)。聯(lián)合用藥組骨小梁多，生長(zhǎng)旺盛，排列致密有序，較多成熟的骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞。同樣，劉海蔚等[12]研究表明PTH(1-34)聯(lián)合降鈣素能明顯增加腰椎BMD，升高骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)。金成春等[13]研究表明甲狀旁腺素聯(lián)合鮭魚(yú)降鈣素治療老年骨質(zhì)疏松合并Garden I股骨頸骨折是一種安全、療效更好的方法。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是骨折愈合的關(guān)鍵性細(xì)胞因子之一，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)家族中的一組多功能細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞增殖、分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，介導(dǎo)軟骨、骨形成[14]。其中BMP-2的作用尤為顯著，BMP-2具有顯著促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞的作用，促進(jìn)骨折愈合。IGF-1是骨骼細(xì)胞分泌的重要生長(zhǎng)因子，參與骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及代謝的調(diào)節(jié)。IGF-1促成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞的分化和增殖，可刺激膠原合成促進(jìn)骨基質(zhì)形成[15]。VEGF作為機(jī)體內(nèi)促進(jìn)血管生長(zhǎng)最主要的生長(zhǎng)因子，在骨折修復(fù)過(guò)程中起著重要的的作用，此外VEGF通過(guò)對(duì)骨原細(xì)胞有直接作用，刺激成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成[16]。TGF-β屬于TGF超家族，TGF-β可刺激骨膜間充質(zhì)細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)成骨和成軟骨細(xì)胞增生，刺激Ⅰ型膠原合成，誘導(dǎo)膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨過(guò)程，TGF-β還可促進(jìn)骨痂形成并提高骨痂強(qiáng)度[17]。此外TGF-β還可促進(jìn)分化的成骨細(xì)胞聚集活化，從而加速骨的修復(fù)和再生。本研究表明去勢(shì)組較假手術(shù)組血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平和骨痂BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯(lián)合用藥組均較去勢(shì)組血清水平和骨痂蛋白表達(dá)均升高，其中以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。

綜上所述，甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素通過(guò)介導(dǎo)增加骨生長(zhǎng)因子(BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1)的表達(dá)，提高去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折骨密度和礦物含量，改善骨組織形態(tài)學(xué)，進(jìn)而加快骨折愈合。骨折修復(fù)愈合是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子的相互作用，甲狀旁腺素聯(lián)合降鈣素在骨質(zhì)疏松性骨折愈合過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用，但其作用機(jī)制以及各細(xì)胞因子間的相互作用關(guān)系尚未完全闡明。因此，進(jìn)一步明確其介導(dǎo)生長(zhǎng)因子對(duì)骨細(xì)胞增殖、分化的作用和機(jī)制，尤其是各生長(zhǎng)因子之間的相互作用是我們今后十分值得深入研究的課題。