馮蓬 陳德強

山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355

骨質疏松癥(OP)是一種以骨量低下、骨微結構破壞，導致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性疾病。2型糖尿病的主要病理生理學特征為胰島素調控葡萄糖代謝能力的下降(胰島素抵抗)伴隨胰島 β細胞功能缺陷所導致的胰島素分泌減少(或相對減少)。近年來國內外多項研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病不僅僅可以導致全身多系統(tǒng)血管損害，也同樣會對骨代謝產(chǎn)生影響，并表現(xiàn)在骨折風險增加[1]。隨人口老齡化，人們生活方式的改變，骨質疏松癥合并2型糖尿病的發(fā)病率居高不下，王玉楠等[2]研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病合并骨質疏松癥高達69.6%。骨質疏松癥與2型糖尿病均是嚴重影響人們生活質量，給個人和國家?guī)沓林亟?jīng)濟負擔的疾病。

骨質疏松癥與2型糖尿病原本是兩種相互獨立的疾病，但隨著臨床資料的積累，兩種疾病間的相互作用關系被逐漸發(fā)現(xiàn)，越來越多的基礎與臨床研究投入其中。但2型糖尿病與骨質疏松癥的關系始終不明確，兩種疾病同時存在骨折風險增加的事實不能夠被骨密度檢測結果所解釋[3]。這需要更加深入的剖析兩者的發(fā)病機制，骨質疏松癥與2型糖尿病同屬于代謝性疾病，兩者的基因易感性存在相互聯(lián)系，如含卷曲結構域的蛋白170(CCDC170)/雌激素受體基因1(ESR1)基因在骨質疏松癥與2型糖尿病中均存在密切聯(lián)系[4]，試圖從分子生物學角度構建兩者相互關系。

隨著生物信息學與計算機技術的飛速發(fā)展，諸多疾病數(shù)據(jù)庫的建立與完善，為我們提供一條在分子水平系統(tǒng)認識復雜疾病相互關系的途徑。骨質疏松癥與2型糖尿病關系極為復雜，二者是涉及多器官、多系統(tǒng)、多靶點的全身代謝性疾病，并且涉及多基因、多通路調控。因此，將多組基因數(shù)據(jù)整合分析，探討骨質疏松癥與2型糖尿病的分子機制相互關系具有重要意義，并為藥物同時干預兩種疾病提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1方法

檢索五大國際公認的疾病數(shù)據(jù)庫以及挖掘Pubmed文獻數(shù)據(jù)庫獲得骨質疏松癥與2型糖尿病相關靶點，其中包括Disgenet數(shù)據(jù)庫[5]、TTD數(shù)據(jù)庫[6]、OMIM數(shù)據(jù)庫[7]、Drugbank數(shù)據(jù)庫[8]、KEGG數(shù)據(jù)庫[9]，分別以“osteoporosis”、“type 2 Diabetes”為關鍵詞進行檢索與篩選。在Disgenet數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)中以關鍵詞進行檢索獲得相關疾病基因；在TTD數(shù)據(jù)庫中(https://db.idrblab.org/ttd/)剔除已中斷研究的藥物作用于疾病的靶點，僅保留藥物處于臨床試驗或已經(jīng)成功的基因靶點；在OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)中僅選用以*號作為標識的基因作為候選靶點；在Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)，為了提高準確性，僅選用經(jīng)食品藥品管理局(FDA)批準且為人類基因/蛋白的藥物所對應的靶點；在KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/)中以疾病名稱進行檢索，分別獲得其藥物作用于疾病的靶點。隨后，將獲得兩組疾病的基因/蛋白數(shù)據(jù)相互映射交集。最后，通過查閱相關文獻以確認所獲得靶點的準確性，最后將所獲得靶點篩選、去重。

1.2DAVID數(shù)據(jù)庫

DAVID數(shù)據(jù)庫[10-11](https://david.ncifcrf.gov/)可用于基因富集分析及信息的可視化，利用DAVID數(shù)據(jù)庫，將上述兩組疾病靶點分別進行基因富集分析以及KEGG通路分析。將兩組疾病相關靶點相互映射并將所獲得的交集靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因富集分析以及KEGG通路分析。最后，利用Cytoscape[12]軟件構建兩種疾病相互交互的通路。

2 結果

2.1以“osteoporosis”為關鍵詞對五大國際公認的數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得與骨質疏松癥相關的疾病基因/蛋白，其中DISGENET數(shù)據(jù)庫10個、TTD數(shù)據(jù)庫12個、OMIM數(shù)據(jù)庫55個、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫35、KEGG數(shù)據(jù)庫6個，以及通過PUBMED文獻數(shù)據(jù)庫獲得的基因/蛋白218個，共計336個?！皌ype 2 Diabetes”為檢索關鍵詞對五大常用數(shù)據(jù)庫進行檢索，以獲得與2型糖尿病相關靶點，其中DISGENET數(shù)據(jù)庫33個、TTD數(shù)據(jù)庫38個、OMIM數(shù)據(jù)庫198個、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫45，共計314個。隨后，將兩組疾病相關基因/蛋白相互映射，獲得相交的基因/蛋白46個(表1)。最后，將所獲得靶點導入PUBMED數(shù)據(jù)庫以驗證其準確性。

2.2將基因/蛋白信息分別導DAVID數(shù)據(jù)庫，物種僅選用“Homo sapiens”，分別分析獲得疾病基因/蛋白信息所富集的通路，并將基因信息可視化。將所獲得基因/蛋白富集通路整理成表格，利用Cytoscape構建兩種疾病交互通路圖，獲得圖1及圖2。

表1骨質疏松癥與2型糖尿病數(shù)據(jù)庫中重疊的差異基因 46個

Table1There were 46 overlapping differentially expressed genes in the osteoporosis and type 2 diabetes databases

TNFHSD11B1IL1RNFTO VEGFABTKSERPINA12SIRT1SOD2FGF21RHOANOS3LEPRATF6IL10PON1IGF1MTNR1BEIF2AK3CCL2IRS2NPYHPVDRTGFB1DPP4P2RX7IL4IL6CALCRIL17 AHLA-ALEPAPOEIGF1RPTGS2HLA-DQA1ACELMNAIL1BHLA-DQB1ALBIL1ACNR1ADIPOQSERPINE1

圖1 骨質疏松癥與2型糖尿病通過DAVID數(shù)據(jù)庫基因富集結果Fig.1 The gene enrichment results of osteoporosis and type 2 diabetes were obtained from the DAVID database

3 討論

基于生物信息學以及計算機技術，通過檢索疾病相關數(shù)據(jù)庫，將獲得的基因通過文獻加以驗證，分別將獲得的基因導入DAVID數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)基因富集分析以及KEGG通路分析，使基因信息可視化。從表中可以看出，骨質疏松癥主要涉及PI3K-AKT信號通路、Rap1信號通路、TNF 信號通路、MAPK信號通路、甲狀腺素信號通路、Ras 信號通路、FoxO 信號通路、NF-κB信號通路、Wnt信號通路等。在這些通路中，一些通路被廣泛研究。如NF-κB信號通路中，在ⅠκB激酶(IKK)復合體激活后，ⅠκB泛素磷酸化降解，NF-κB游離并轉移至細胞核內，作為轉錄因子調節(jié)破骨細胞分化、活性及凋亡[13]。如Wnt信號通路中，下游蛋白復合物因存在Wnt信號刺激而不發(fā)生磷酸泛素化降解而積聚在細胞核內，進而啟動靶基因如c-myc、cyclinD1的轉錄，促進細胞增殖[14]。2型糖尿病涉及的通路包括PI3K-Akt信號通路、AMPK信號通路、胰島素信號轉導通路、脂肪細胞因子信號通路、FoxO信號通路、cAMP信號通路、HIF-1信號通路、胰高血糖素信號通路、Ras信號通路等。許多研究亦建立在這些通路中，如徐寒松等[15]認為，黃芪多糖能夠通過激活PI3K/AKt/eNOS信號通路促進2型糖尿病患者內皮祖細胞增值和向內皮細胞的分化。劉雪芹等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖可增強胰島素信號通路敏感性，改善葡萄糖代謝，從而緩解糖尿病小鼠胰島素抵抗及高血糖癥狀。

圖2 利用Cytoscape 構建骨質疏松癥與2型糖尿病存在相互交互的通路(圖中Signaling pathway已被省略)Fig.2 Cytoscape was used to construct the interactive pathways between osteoporosis and type 2 diabetes

在骨質疏松癥與2型糖尿病相關聯(lián)的通路表中，我們看到大量通路是重疊的，這表明骨質疏松癥與2型糖尿病關系密切，存在著廣泛的相互作用關系，這些通路包括PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、HIF-1信號通路、AMPK信號通路、Rap1信號通路、Jak-STAT信號通路、Ras信號通路、NF-kappa B信號通路、T細胞信號通路、TNF信號通路、VEGF信號通路、脂肪細胞因子信號通路、fc-εri信號通路。在PI3K/Akt通路中，王秉義等[17]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路在丹參素拮抗成骨細胞的凋亡過程中起到關鍵作用，能夠上調pAkt表達，且BAX、AIF、cyto-C等與細胞凋亡相關蛋白表達降低。在劉美曉等[18]的研究中發(fā)現(xiàn)，絲膠能夠上調PI3K以及Akt表達，改善糖尿病狀態(tài)下PI3K/Akt通路的異常，發(fā)揮降血糖作用；在NF-κB信號通路中，吳昆鵬等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的和旁路的NF-κB信號通路影響細胞、破骨細胞增殖、分化，NF-κB的高表達使破骨細胞增多、骨吸收增強、骨形成減少。研究[20]表明，NF-κB的激活也許是導致β細胞功能異常的關鍵媒介，同時亦可能是糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展的始動因素之一；在Jak-STAT 信號通路中，謝麗華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸在治療腎陰虛證骨質疏松癥中差異表達基因有25條，上調11條，下調14條，其中JUN、JUNB治療后明顯上調。蘇靜等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在白芍總苷治療糖尿病大鼠過程中，腎組織Jak-STAT 信號通路中TGF-β1蛋白表達明顯增高；楊亞軍等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，某些藥物能夠通過FOX通路保護氧化損傷的成骨細胞來調節(jié)骨質疏松癥；黃荷等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OX是胰島素信號通路的下游關鍵分子，受上游PI3K/AKT信號磷酸化調節(jié)，與胰島β細胞的細胞周期、細胞凋亡、衰老及代謝有著密切關系。因此，在諸多信號通路中，骨質疏松癥與2型糖尿病相互影響、相互作用，有著密不可分的關系。

2型糖尿病與骨質疏松癥的相互影響是多途徑的、綜合的，高糖環(huán)境、胰島素、糖基化產(chǎn)物、降糖藥物等都可以對骨代謝產(chǎn)生影響，是一個復雜的全身性過程[26]。研究[27]表明，高糖環(huán)境可以改變成骨細胞的生物礦化過程，可以增加RANKL、骨鈣素、BSP和Cbfa，并降低OPG表達，高葡萄糖可增加IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1和IL10mRNA的表達，增加礦物質的數(shù)量，降低礦物質的質量。不同濃度的葡萄糖對成骨細胞作用存在差異，有研究[28]發(fā)現(xiàn)，當葡萄糖濃度逐漸升高時，其誘導成骨細胞凋亡作用更加明顯，提示高糖對成骨細胞有毒性作用。高糖環(huán)境不僅僅對成骨細胞存在影響，對破骨細胞亦存在影響，Williams等[29]發(fā)現(xiàn)，破骨細胞存在葡萄糖濃度依賴性，在7～25 mmol/L的葡萄糖濃度能夠維持最大化的骨吸收活動。因此，調控血糖與抗骨質疏松治療是治療2型糖尿病骨質疏松癥的基礎環(huán)節(jié)，但血糖的控制并不能因此改變糖尿病對骨代謝的影響，內在的分子機制仍然對骨代謝產(chǎn)生重要影響。反觀目前治療2型糖尿病的藥物，有些藥物如噻唑烷二酮類藥物、磺脲類藥物等甚至可以增加骨量丟失與骨折風險[30-32]，這有可能會對高血糖并發(fā)癥的控制和抗骨質疏松癥的治療帶來不利影響。在能夠同時調控2型糖尿病與骨質疏松癥的通路中尋找共同的作用靶點，使得藥物能夠從基因水平調控糖代謝、骨代謝，是較為理想的治療2型糖尿病骨質疏松癥的藥物。而根據(jù)基因富集結果的對比，2型糖尿病骨質疏松癥的疾病機制以PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、HIF-1信號通路、AMPK信號通路、Rap1信號通路、Jak-STAT信號通路、Ras信號通路、NF-kappa B信號通路、T細胞信號通路、TNF信號通路、VEGF信號通路、脂肪細胞因子信號通路、fc-εri信號通路等信號通路為主，同時針對以上這些通路的藥物亦有可能同時對骨代謝與糖代謝同時產(chǎn)生雙向調控作用，但這需要進一步實驗的驗證。

骨質疏松癥與2型糖尿病均存在龐大的疾病基因網(wǎng)絡，但這些網(wǎng)絡并不是孤立存在的，而是存在密不可分的聯(lián)系。通過相關平臺獲得的兩種疾病網(wǎng)絡相交叉的部分正是兩種疾病相關聯(lián)的部分，也是研究骨質疏松癥與2型糖尿病相互關系的突破點，同時可以為藥物同時干預兩種相互關聯(lián)的疾病提供可能的靶點。當然，對差異表達的基因信息進行整合處理依賴于生物信息學與計算機技術的發(fā)展，疾病數(shù)據(jù)庫的完整性、準確性直接決定著整合后信息的可靠性。本研究在運用生物信息相關數(shù)據(jù)進行分析時并未將基因的表達量和對相關靶點的激活程度一并考慮在內，這需要對生物信息學以及疾病數(shù)據(jù)庫更進一步的完善與發(fā)展，研究結果仍需要后續(xù)進一步實驗驗證與支持，使理論更加可靠。