任愛(ài)武 杜娟

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科

血清甘膽酸是膽酸和甘氨酸結(jié)合成的結(jié)合型膽酸之一，在肝細(xì)胞里面，膽固醇經(jīng)過(guò)特別復(fù)雜的酶促反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)槌跫?jí)膽汁酸。其中有膽酸和鵝去氧膽酸。膽酸的類(lèi)固醇核上面有三個(gè)羥基(C3、C7、C12），側(cè)鏈末端的羥基以肽鍵和甘氨酸結(jié)合而成。血清甘膽酸正常的代謝途徑是腸―肝循環(huán)，血清甘膽酸由肝細(xì)胞合成，通過(guò)毛細(xì)膽管、膽管排進(jìn)膽囊，隨著膽汁進(jìn)入十二指腸，幫助食物進(jìn)行消化。95%的膽酸在回腸末端被重吸收，經(jīng)過(guò)門(mén)靜脈再回到肝臟，被肝細(xì)胞攝取后再利用。在血清中以蛋白結(jié)合形式為主而存在，溢入體循環(huán)的總量小于1 %。在正常情況下,外周血中膽酸含量甚微極其少,正常成人不管是空腹還是餐后,其血清甘膽酸濃度都穩(wěn)定在低水平。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞攝取甘膽酸的能力下降，導(dǎo)致血中的甘膽酸含量增高；膽汁郁滯時(shí)，肝臟排泄膽酸就會(huì)發(fā)生障礙，從而返流血液循環(huán)的甘膽酸含量就會(huì)增高，使血中甘膽酸含量也增高。所以，測(cè)定血清甘膽酸是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞功能和肝膽系物質(zhì)循環(huán)功能的敏感指標(biāo)之一[2]。

本試驗(yàn)評(píng)估的甘膽酸試劑盒，采用均相酶免疫法測(cè)定樣本中甘膽酸(CG)的含量。本試驗(yàn)從攜帶污染率、精密度、線性、最低檢測(cè)限、參考范圍驗(yàn)證等方面測(cè)試甘膽酸試劑盒的性能指標(biāo)，評(píng)估其臨床應(yīng)用能力。

一、材料與方法

（一）對(duì)象

1.攜帶污染率：將已知甘膽酸高濃度值血清（約40μg/ml）、分裝5份于-20°C凍存，和去離子水5份，用于攜帶污染試驗(yàn)[3]。

2.精密度驗(yàn)證混合血清：將已經(jīng)知道甘膽酸濃度的患者的血清進(jìn)行混合，制備高濃度和低濃度（約40μg/ml和2.5μg/ml）的兩份混合血清，各分裝為20份，置于-20°C冷凍保存用作精密度試驗(yàn)。

3.線性：將已經(jīng)知道甘膽酸濃度的患者的血清進(jìn)行混合，制備高濃度（約40μg/ml）的一份混合血清，和準(zhǔn)備0水平校準(zhǔn)品，用于線性試驗(yàn)。

4.靈敏度的確定：采用0水平定標(biāo)品連續(xù)進(jìn)行10次測(cè)定, 采用多個(gè)水平校準(zhǔn)物里的最低水平（1水平）的樣本連續(xù)進(jìn)行3次測(cè)定，用作最低檢測(cè)限的試驗(yàn)。

5.參考范圍驗(yàn)證血清：參考文獻(xiàn)[4]所述，從2015年9月份某醫(yī)院健康體檢中心體檢人群中選擇出臨床診斷基本正常, 肝功能和腎功能以及脂類(lèi)項(xiàng)目的結(jié)果，還有腫瘤標(biāo)志物的結(jié)果都正常的被檢測(cè)者的血清，一共50例，用作參考范圍的驗(yàn)證。

（二）儀器與試劑

1.儀器：OlympusAU5400全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼庫(kù)爾特/美國(guó)） 。

2.主要試劑：浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司出品的甘膽酸測(cè)定試劑盒(均相酶免疫法)（批號(hào)2015060028）、配套校準(zhǔn)品CG-S（批號(hào)150625 ）、配套質(zhì)控品（批號(hào)150116，150117）。

（三）方法

1.攜帶污染率：用甘膽酸試劑測(cè)定高濃度值血清（約40μg/ml）、去離子水，連續(xù)測(cè)5天，每天測(cè)3次,利用下面的公式計(jì)算出每天的攜帶污染率, 并計(jì)算出5天的均值得到平均攜帶污染率，并確認(rèn)試劑是否攜帶污染率達(dá)標(biāo)[5]。樣品攜帶污染率= (空白1濃度-空白3濃度) /(高值1濃度-空白3濃度)×100%。

2.精密度評(píng)價(jià)：根據(jù)CLSI EP15-A文件[6]所提供的方案，用甘膽酸試劑測(cè)定出高、低2個(gè)水平（甘膽酸濃度約40μg/ml和2.5μg/ml）的混合血清，連續(xù)測(cè)5天，每天測(cè)4次。計(jì)算出每個(gè)水平的批內(nèi)和總變異（CV%within、CV%tatal）,還要確認(rèn)它的不精密度范圍是不是與廠商的名義標(biāo)注的不精密度相符合。

3.線性范圍評(píng)價(jià)：甘膽酸試劑盒標(biāo)定的線性范圍為0.8～50μg/ml，取甘膽酸高濃度血清樣本（38.21μg/ml）為H號(hào)樣本及0水平校準(zhǔn)品（理論值為0μg/ml）為L(zhǎng)號(hào)樣本，按1L、1/16H、1/8H、1/4H、1/2H、1H,配制成6個(gè)不同濃度梯度的混合血清。每份混合血清測(cè)定3次,記錄測(cè)定結(jié)果。按照CLSI EP6-A文件[3]提供的方案進(jìn)行數(shù)據(jù)檢查，觀察有無(wú)離群值，判斷是否有重復(fù)性，然后進(jìn)行多元線性回歸，將其結(jié)果擬合1次、2次、3次多項(xiàng)式，最后繪制出散點(diǎn)圖并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4.靈敏度的確定: 用0水平定標(biāo)品連續(xù)進(jìn)行10次測(cè)定, 用多水平校準(zhǔn)物中的最低水平(1水平) 樣本連續(xù)進(jìn)行3次測(cè)定。通過(guò)下面的公式計(jì)算出測(cè)定下限( LOD) 和定量下限( LOQ) , 比較其與試劑說(shuō)明書(shū)提供的檢測(cè)下限是否相同，如果高于試劑說(shuō)明書(shū)所提供的檢測(cè)下限，就要根據(jù)臨床的需要判斷是否可以接受。

式[4]中: A代表0水平原始吸光度的標(biāo)準(zhǔn)差, B代表1水平的濃度,C代表0水平原始吸光度的均值, D代表1水平原始吸光度的均值。

5.參考范圍驗(yàn)證：使用試劑測(cè)定50份參考范圍驗(yàn)證血清中甘膽酸濃度，參考文件[4]進(jìn)行評(píng)價(jià)。計(jì)算`x±3s, 判斷是否有檢測(cè)值落在`x±3s 以外的, 如果有的話, 將該值去除后再次進(jìn)行計(jì)算, 然后判斷現(xiàn)有的參考范圍和計(jì)算所得的范圍是否相符。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Microsoft Excel 2003及SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。線性回歸用簡(jiǎn)單線性回歸進(jìn)行分析，以P＜0.05表示回歸有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.攜帶污染率：甘膽酸試劑的平均攜帶污染率為0.47，符合臨床試劑盒的要求。

2.精密度評(píng)價(jià)：甘膽酸試劑的實(shí)際測(cè)定精密度小于試劑盒所標(biāo)注的精密度，變異較小，可以滿足臨床的應(yīng)用。

3.線性范圍評(píng)價(jià)：甘膽酸試劑的預(yù)期值與實(shí)際測(cè)定值散點(diǎn)圖如圖1所示。試劑評(píng)價(jià)的樣品濃度范圍為0～38.21μg/ml，數(shù)據(jù)組里沒(méi)有明顯的離群值，最佳擬合方程為一次多項(xiàng)式。試劑的預(yù)期值和實(shí)際測(cè)定值擬合的相關(guān)方程為y=bx+a，其中b=0.9674，a=0.4602，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.975，故試劑的線性范為良好。

圖1.甘膽酸的線性圖

4.靈敏度：LOD=0.02μg/ml，LOQ=0.10μg/ml，試劑說(shuō)明書(shū)提供的最低檢測(cè)下限為0.8μg/ml，故此靈敏度符合要求。

5.參考范圍驗(yàn)證：入選的50位健康人中，男性25名，女性25名，年齡范圍在20～70歲之間。測(cè)定50份入選者血清中甘膽酸濃度, 計(jì)算`x為1.33，SD為0.44，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)測(cè)定值（3.47）落在`x±3s 的外面,除去該測(cè)定值之后再次進(jìn)行計(jì)算,判斷廠家提供的參考范圍和計(jì)算所得的范圍相符。

三、討論

甘膽酸（CG）是主要膽汁酸之一，它的代謝是肝臟的一個(gè)主要功能。血清甘膽酸是檢測(cè)肝細(xì)胞損傷的敏感性與特異性的指標(biāo)。有研究顯示血清結(jié)合甘膽酸放射免疫分析對(duì)消化系統(tǒng)生理和病理的研究及臨床肝功和肝癌的診斷都有重要意義[7]。除此以外，甘膽酸對(duì)妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥及膽道系統(tǒng)疾病等多種疾病的診斷也都有重要的意義[8]。目前，臨床用于評(píng)價(jià)肝功能的指標(biāo)有多種，但甘膽酸反映肝細(xì)胞的損害比目前臨床上常用的ALT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）、AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）等更敏感[7]，能早期發(fā)現(xiàn)輕度肝損害，對(duì)區(qū)別慢性肝炎病情嚴(yán)重程度有幫助。有研究顯示，急性肝炎患者血清甘膽酸水平與ALT呈正相關(guān)；而重癥肝炎時(shí)，由于酶膽分離，ALT正常，而甘膽酸仍然升高，在肝病轉(zhuǎn)為慢性時(shí)，甘膽酸仍保持高水平。因此，甘膽酸的檢測(cè)也可以作為肝臟疾病診斷和治療以及預(yù)后分析的重要依據(jù)。

血清甘膽酸也是妊娠晚期的血清里最主要的膽汁酸成分之一。孕婦正常妊娠時(shí)的血清甘膽酸水平會(huì)隨著孕周期逐漸升高的,直到足月時(shí)孕婦甘膽酸的水平都比不懷孕的時(shí)候增加30%～60% 。很多研究表明,孕婦中血清甘膽酸的水平由于妊娠期分泌大量雌激素、孕激素和胎盤(pán)合成以及代謝負(fù)荷的增大,可能會(huì)導(dǎo)致肝膽系統(tǒng)的變化[9],孕婦就比較容易患上妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥 。該病患血清甘膽酸水平比正常孕婦高,達(dá)10～100倍，該病患增高的血清甘膽酸會(huì)增加羊水污染率、早產(chǎn)率、胎兒宮內(nèi)窘迫率以及剖宮產(chǎn)率,當(dāng)甘膽酸增高到10 倍以上的時(shí)候,以上危險(xiǎn)會(huì)加大。同時(shí),該病患會(huì)出現(xiàn)膽汁排泄障礙，膽汁淤積和膽栓，導(dǎo)致外周循環(huán)膽酸堆積，從而血清甘膽酸水平增高，皮膚會(huì)出現(xiàn)瘙癢的癥狀。由于孕婦的血液和羊水里膽汁酸都升高了,還會(huì)造成子宮內(nèi)胎兒出現(xiàn)缺氧，引起早產(chǎn)或者胎兒宮內(nèi)窘迫等。通過(guò)國(guó)內(nèi)的有關(guān)報(bào)道，得知胎兒宮內(nèi)窘迫癥發(fā)生率高達(dá)44%～60.6%，早產(chǎn)率也達(dá)13%～42.4%[10]。

目前，檢測(cè)血清甘膽酸含量主要有酶聯(lián)免疫法和RIA以及化學(xué)發(fā)光免疫分析法等方法[11]。還有一些不適合廣泛應(yīng)用到臨床檢驗(yàn)的，如氣液色譜、高效液相色譜，以及氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用等[12]。

本試驗(yàn)所評(píng)估的甘膽酸試劑盒，采用均相酶免疫檢測(cè)法，能夠?qū)崿F(xiàn)在全自動(dòng)生化儀器上對(duì)甘膽酸的大批量檢測(cè)及快速化檢測(cè)，靈敏度高、特異性強(qiáng)。

本次試驗(yàn)參考CLSI文件進(jìn)行部分調(diào)整后對(duì)甘膽酸試劑的攜帶污染率、精密度、線性、最低檢測(cè)限、參考范圍驗(yàn)證等方面進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示該試劑的性能參數(shù)能滿足臨床檢測(cè)需求，為臨床診斷提供可靠的依據(jù)。